组织学与胚胎学的研究方法.doc

组织学与胚胎学的研究方法 组织学与胚胎学的研究离不开显微镜，由于光学显微镜的改进和电子显微镜的广泛应用以及新研究方法的不断出现，近年来发展十分迅速，现仅就几种主要研究方法，简单介绍如下：1. 固体组织的研究方法：应用一般光学显微镜，观察组织切片是组织学研究的最基本方法。取动物新鲜组织块，用固体液浸泡（常用固体液：酒精、甲醛、苦味酸等），使组织中的蛋白质迅速凝固，以保持生活状态下的结构。固定好的组织再经脱水、透明等步骤后包埋于石蜡中，包埋好的组织块用切片机切成5-7um厚的薄片。贴于载玻片上，然后脱蜡、染色。为了显示不同结构可采用不同的染色方法。常用的为苏木精（hematoxylin）伊红（eosin）法，简称HE染色或普通染色。经染色的标本最后用树胶加盖玻片封固，制成永久标本。在教学中我们观察的切片大部分用这种方法制成。有些液态组织如血液可用涂片方法制备标本。有些组织本身很薄（如腹膜、疏松结缔组织），可制成薄层张片标本。涂片和张片也要经过固定、染色等步骤。2. 活细胞的研究方法：观察生活状态的细胞常用组织培养（tissue culture）方法。组织培养也称体外实验，在无菌条件下，把活细胞或活组织放在体外适宜的环境中培养成活，对培养的细胞可附加各种条件（如温度、激素、药物等）对细胞直接影响，观察细胞运动、吞噬、分化、繁殖等的变化。组织培养是研究活细胞的最好方法。在培养皿内分离出单个细胞，进行培养后可获得由单个细胞繁殖的纯细胞株，成为克隆（clone），克隆技术广泛应用用于生物学、医学、胚胎学各个领域，成为研究遗传学、细胞免疫、病毒、肿瘤防治等重要手段。 细胞融合（cell fusion）是用人工方法将两个或两人以上的细胞合并成一个新细胞的技术。有的新细胞具有很强的生命力，可培育出新的动物杂交品质，其应用前景非常广阔。3. 组织化学和细胞化学方法：组织化学和细胞化学方法，是通过化学或物理反应形成有色沉淀来显示组织细胞内的化学成分。通过显微镜观察，对组织和细胞内的化学成分进行定位、定性和定量研究。如过碘酸雪夫氏反应（periodic acid schiffs reaction 或简称PAS反应）是显示细胞内糖类的方法；油红O可使细胞内的脂滴呈红色；甲基绿-焦宁染色可使DNA呈蓝绿色，RNA呈红色。4. 免疫组化技术：免疫组织化学是利用特异性的抗原抗体反应来研究组织或细胞内所含抗原物质的定位和定量的技术。凡具有抗原性的物质，如多肽、激素、酶等，即使含量极微也可用此方法检出。由于组织和细胞内的抗原抗体反应是不可见的，所以需要事先将某种标记物结合在抗体上，借此在光镜和电镜下观察是否发生特异性反应，以及反应的部位。根据标记物的种类可将免疫组化方法分为荧光抗体法、酶抗体法、金标记抗体法、放射性同位素法等。5. 几种特殊显微镜的应用： 荧光显微镜：用来观察组织细胞中的荧光物质。如维生素A可显绿色荧光；若用吖啶橙染色可使细胞内的DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橘红色荧光。荧光显微镜广泛应用于免疫荧光抗体法，用荧光素标记抗体，用于检测抗原的存在和分布。 相差显微镜：多用于观察活细胞的各种形态。相差显微镜可将各种结构由于对光产生不同的折射作用，使无色透明样品中的微细结构转换为光的明暗差，使观察的细胞反差明显、景象清楚，是细胞生物学、细胞工程、组织培养等现代生物学必备的研究工具。 暗视野显微镜：此种显微镜有一个暗视野集光器，使光线不能直接进入物镜而呈暗视野，而让标本内的小颗粒产生的衍射光或折射光进入物镜，颗粒在暗视野中呈明亮的小点，如同在暗室中摄入一束光线内可见到微小的尘埃一样。暗视野显微镜分辨率较高，适用于观察细胞核和线粒体的运动。 共焦激光扫描显微镜：共焦激光扫描显微镜是最近十几年研制成的高光敏度、高分辨率的新型仪器。它以激光为光源，光束经聚焦后落在样品不同深度的微小一点，并作移动扫描，通过电信号彩色显像，经过微机图像分析系统进行二维和三维图像处理，共焦激光扫描显微镜可对细胞的多种功能进行全自动、高效、快速的微量定性和定量测定。 其他如偏光显微镜用于研究组织晶体物质及纤维等的光学性质，紫外线显微镜用于研究细胞内核酸的分布和定量等。6. 细胞和组织的超微结构观察：应用电子显微镜观察细胞和组织的结构，由于它的分辨率高，在电镜下显示的结构称超微结构。 透射电子显微镜（TEM）：透射电子显微镜是以电子束穿透样品，经聚合放大后显像于荧光屏上进行观察和摄片。其分辨率达0.2nm，可放大几万倍至几十万倍。用电镜观察的样品要制成超薄切片，超薄切片厚50nm，也要经过固定、包埋、切片、染色等步骤。放大的图像在荧光屏上出现黑白反差的影像，呈现黑色的结构为电子密度高，浅色结构为电子密度低。 扫描电子显微镜（SEM）：用于观察组织表面的立体结构，样品经真空干燥镀膜后即可观察，经电子束扫描在荧光屏呈现富有立体感的表面图像，如细胞表面的突起、微绒毛等。7. 组织学研究的新技术：随着科学技术的发展，高科技仪器的开发应用，出现了许多新研究技术，仅简单介绍几种： 细胞形态计量数（cell morphometry）:细胞形态计量数是运用几何学和统计学原理，应用图像分析仪测算出组织和细胞内各微细结构的体积、数量、大小及分布等数值的一种新科技手段。 流式细胞术（flow cytometry，FCM）：也称激发荧光细胞分类术，是借助激发荧光细胞分类器（流式细胞仪）对单个细胞逐个进行高速定量分析和分类的一种技术，该仪器是集喷射、激光、电子、电脑等综合性技术的高科技产品。特点是速度快、精确性高、灵敏度好，已成为一种重要手段广泛应用于细胞动力学、遗传学、免疫学等的研究。 显微