血小板功能检测及其临床应用.doc

血小板功能检测及其临床应用【关键词】 血小板; 功能检测; 临床应用血小板检测方法可归纳为出血、血栓和药物监测3大类。虽则有些方法能应用于多种检测目的，但为特殊目的而创建的方法亦有重要价值。故在检测时应合理地运用。1 出血性疾病监测中的应用血小板的基本功能是黏附、聚集、分泌、促凝血、血块回缩。通过这些功能维持着正常人体的初期止血作用。由于这些功能异常而导致的出血疾病包括遗传性和获得性两类，在有些疾病同时会有血小板功能异常和数量减少。1.1 遗传性血小板功能异常疾病 黏附受体蛋白异常：GPIb(BSS,血小板型vWD,BolinJamieson 综合征)、GPb/a(血小板无力症)、GPa/a、GP、GP。 可溶性激动剂受体异常:TXA2受体,P2Y12受体、2肾上腺素能受体。 血小板颗粒异常:颗粒(贮存池缺陷、HermanskyPudlak综合征等)、颗粒 (灰色血小板综合征，Quebec血小板病等)。 信号传递途径异常:TXA2途径异常、Ca离子流动异常、Gq缺陷、GS高反应、PLCpleckstrin磷酰化缺陷。 膜磷脂异常:Scott综合征、Stormorken综合征。 其他异常:原发性释放异常、Montreal综合征、EhlersDanlos综合征、 MayHegglin综合征等1.2 遗传性血小板数量减少疾病 体积减小：WiskottAldrich综合征、性联血小板减少症。 体积正常：家族性血小板病、先天性无巨核细胞性血小板减少症。 体积增大：巨大血小板综合征、血小板型vWD、MayHaegglin异常、灰色血小板综合征、Montreal血小板综合征。1.3 获得性血小板功能异常 这种异常十分常见，可由下列不同原因引起： 药物、食物和维生素; 慢性肾衰; 体外循环; 骨髓增生异常疾病; 抗血小板抗体等。血小板功能缺陷检测的方法包括： 血细胞分析仪在测定血小板数量及外形大小中应用; 血小板功能:出血时间(血小板功能分析仪，(FPA100R)、 黏附性测定、 聚集功能测定、 释放功能测定(致密颗粒：5HT、ADP、ATP、颗粒缺陷HermanskyPudlak 综合征、ChediakHygashi 综合征(荧光法)、颗粒：TF4、TG(颗粒缺陷灰色血小板综合征、Quebec 血小板病、Jacobsen或ParisTrousseau 综合征)(ELISA法，试剂盒),PF3有效性; Ca2+释放与内流,、血栓烷形成、cAMP、GAMP;血块回缩; 膜受体分析采用流式细胞术和电泳术(黏附受体GPb/a、GPb，激动剂受体P2Y12、GP); 基因分析采用分子生物技术; 其他(超微结构)。上述检测方法目前巳成为疾病诊断的基本手段，但随着对疾病的病理机制的深入研究以及包括血小板信息传递在疾病中的新的认识，许多蛋白分析技术巳逐渐成为研究方法中的一部分，但它们的应用可能仅限于研究目的而言，而不适合一般医院的临床检测应用。血小板体积测定不仅能反映血小板生成及衰老，而且在鉴别遗传性血小板疾病中也是一项十分有用的指标。在巨大血小板综合征中的巨大血小板在末梢血涂片可达80%，其直径达到20 m以上。最新也有报道非巨大血小板综合征而血小板体积明显增大数量减少病因不清的遗传性巨大血小板减少症。体内出血时间结合血小板数曾是血小板数量与质量异常所致出血的筛选试验，但由于出血时间存在种种不足而被弃之不用。血小板黏附性所测得的结果是血小板聚集和黏附的总和，不能独立反映黏附功能也被弁之。PFA100TM是一种模拟体内初期止血的测定仪，又名“外出血时间”，结果以血小板闭塞网眼停止血液流动的“闭合时间”表示。故可以检测与血小板黏附、聚集、栓子形成的初期止血障碍相关的疾病，血栓性疾病、GPb/a拮抗剂等抗血小板药物监测、血小板贮存、血管性血友病及DDAVP治疗、肝肾功能疾病等。与出血时间试验相比，在诊断vWD中的敏感性90%。由于此项检测所需费用较高，限制了其广泛应用。血小板聚集性测定是被应用最广泛、发展和改进最多的一项测定。至今为止，巳发展而成的血小板聚集仪包括有比浊法、阻抗法(全血血小板聚集仪)、光散射法和Verify Now分析仪(Ultegra快速血小板功能分析仪)。在测定血小板聚集的仪器中，设计有可以同步测定血小板腺核苷酸释放和血小板胞浆Ca2+浓度的装置，具有多功能性。比浊法最常用，诱导剂通常为ADP、胶原、花生四烯酸和瑞斯托酶素等4种。但存在标本分离、制备、诱导剂种类与浓度选择、正常值设定等影响因素，缺乏各实验室之间的可比性。在一项误差分析中，其总体的SD为3.7%7.7%。所以，对一份聚集率为64.81%7.7%,其分布范围49%80%，从个体化角度进行判断分析时，其意义较为有限。在遗传性血小板功能性疾病中,由于聚集反应显著下降，这类误差不影响临床诊断，是一项十分有用的指标。其他各项试验譬如颗粒释放产物、花生四稀酸代谢产物，血小板膜磷酯酰丝氨酸、Ca2+、膜糖蛋白、基因分析等项目在诊断疾病中仍被继续广泛应用，是诊断血小板功能疾病所必需的基本检测项目。但由于遗传性血小板疾病在临床上颇为少见，一般医院很难具有独立地全面检测这类疾病的能力，许多试验仍未能广泛应用展开。2 血栓性疾病监测中的应用在血栓性疾病中存在着血小板的短暂或持续活化。活化的血小板其形态、功能或蛋白的结构变化，这些变化构成了活化标志物检测的基础。目前用于血栓性疾病检测的方法有:2.1 血小板聚集 是至今为止在检测血栓性疾病中仍能应用的一项试验，但其灵敏度不高。譬如比浊法，它既不能检出低于5个血小板组成的聚集反应，也不能检测循环血小板聚集体。鉴于这些需求，随后出现了一些新的方法，譬如Wu & Hoak报道的全血血小板聚集体检测法,血小板对ADP/AA聚集反应阈值和自发性血小板聚集体测定法, 检测血小板聚集反应中所形成大小不同的聚集体激光衍射法，或采用血小板计数仪测定聚集后的标本中剩余的血小板数等。PA200型聚集仪(Kowa,Japan)是通过光散射及一系列复杂镜片组建成的激光衍射仪，能检出PRP中由2至3个血小板组成的聚集体。用此项检查，发现在急性冠状动脉综合症中存在100个血小板组成的聚集体，现已应用于急性冠状动脉综合征、脑卒中和TTP等血小板高反应性疾病中。但在遗传性的黏性血小板综合征中，患者血小板对ADP和/或肾上腺素诱导的血小板聚集反应增高，采用比浊法血小板聚集仪即可予以诊断。血小板聚集虽然存在不灵敏的反映血栓形成，但最近人们发现，通过计算方法的改进成为可预示经皮冠脉介入治疗后患者心肌损伤的标志物。2007年Marcucci等在367例PCI后发生急性心梗患者的心肌损伤测定中进行了此项研究。此项方法命名为残留血小板反应性(residual platelet reactivity,RPR)检测法。它以血小板聚集率和PFA100中测得的闭合时间为基础，以超出对照组血小板聚集率第90%者值或低于PFA100中闭合时间203 s(CT/EPI )作为临界值，计算 RPR。采用此法检测时所测得的RPR值与反映心肌梗死的指标CKMB和cTnl基本一致(P TXB2、 TSP、TG血小板聚集。血小板检测在血栓性疾病中具有多方面的应用价值，包括血栓前状态的检测; 指导抗血小板药物治疗及疗效判断; 血栓性疾病的鉴别诊断; 预后。譬如缺血性脑卒中其CD 62,CD 63升高在脑血管自身病变引起的患者较心源性中为高;在急性心肌梗死与心绞痛比较时，前者血小板单核细胞聚集体高于后者。在用阻抗法检测孕妇是否发生先兆子痫时，在妊娠25周前用ADP,胶原或花生四烯酸诱导血小板聚集增高时，其阳性预示率几乎100%。3 药物监测中的应用实验室监测抗血小板药物的目的在于药物的安全性和有效性。安全性主要是指出血副作用，但在常规的剂量下，药物的出血副作用是很轻微，通常不需监控。随着ASA和氯吡格雷“抵抗性”的报道，引起了人们的重视。在过去的20多年中，人们对不同方法在“抵抗性”方面检测意义作了评估。由于每一种药物都有它们特定的作用点靶向，检测需要能反映靶向的状态。 “抵抗性”的检测从原理、方法上与出血疾病和血栓性疾病间存在着很大区别。3.1 ASA抵抗性及其监测： ASA是应用最广泛的血小板聚集的抑制剂，它通过乙酰化环氧化酶1(COX1)中529位丝氨酸的羟基而不可逆地灭活该酶活性，而阻碍花生四烯酸与385位酪氨酸的活性位点结合，阻止血栓烷A2(TXA2)的形成。ASA抵抗性的定义包括实验室定义和临床定义，前者以实验室检测指标判断，ADP诱导的血小板聚集率高于特定水平，显示抑制作用很低;后者以临床缺血事件发生率来评定。ASA抵抗性早在1993年Grotemeyer等发现在脑卒中患者有报道，2005年Campbtell等汇总文献资料，根据血小板功能(出血时间、血小板聚集比值、比浊法、全血法血小板聚集、11去氢TXB2以及PFA100TM等)检测的结果，显示采用不同检测方法和判断标准所报道的ASA抵抗性发生率范围相当大(8%64%)，而采用特异的靶向反应及其产物相关的试验血清TXB2和花生四烯酸诱导的血小板聚集试验，ASA抵抗性的发生率并不高，仅为1%1.7%和53%,其阴性预示值为99%，阳性预示值为12%,其灵敏度为93%,特异性为50%。预示在无ST段升高的急性冠脉综合征(ACS) PCI后头一个月的CV发生可能性。因此，此项指标除作为监测氯吡格雷抗血小板作用外，也是无ST段升高的急性冠脉综合征临床结局(作PCI者)的良好预示标志物, PRI VASP值升高预示氯吡格雷低反应者伴有复发性心肌缺血事件发生的增加。(6)MeSAMP试验：此法由Neubauer于2008年描述。MeSAMP为血小板P2Y1抑制剂，当MeSAMP存在时，血小板对ADP的反应由于P2Y1被MeSAMP阻断，所以ADP对血小板的作用只能通过P2Y12受体途径，由此而能较特异地反映出氯吡格雷对P2Y12受体的抑制状况。试验采用阻抗法进行。在161例的测定中原先检测到的氯吡格雷低反应者38例(23.6%)，而经此法鉴别后确氯吡格雷低反应者仅为8例(5%)，而发现其中3例为P2Y12受体不足所致。由此项因此试验提示，在鉴定药物的抵抗性方面尚有许多未知因素需我们认真、细致地去探索。根据2006年Michelson在欧洲心脏病杂志的建议，对氯吡格雷抵抗性的监测可首先对P2Y12受体特异的VASP 磷酰化作用检测 (流式细胞仪)，其次为Verify Now P2Y12 assay和ADP诱导的比浊法血小板聚集。3.3 GPb/a拮抗剂监测：GPb/a拮抗剂在临床应用中存在出血和血小板减少的副作用，有人怀疑它与上述两种药物一样，可能存在“抵抗性”。目前认为采用能作床旁检测的Verify Now 分析仪是首选的试验。它在反映GPb/a功能受抑制程度上更为特异，与血小板聚集仪中测得的GPb/a受体阻断率一致。也有人报道在GPb/a拮抗剂可采用全血单个血小板计数法和PFA100TM仪测定。在比浊法血小板聚集仪中的ADP诱导的血小板聚集性测定虽然存在灵敏性不高，重复性差和技术要求高等不足，但在一般的临床实验室中仍不失为一项可以接受的监测手段。国产静脉注射型GPb/a拮抗剂(欣锥宁)现己在临床应用，实验室监测在这类药物中的意义将会累积更多的经验。4 研制中的血小板检测装置4.1 体外受刺激的血小板功能监测仪 为了模拟体内止血过程中所发生的血小板一系列反应(黏附、活化、聚集等)，除目前临床上已经应用的PFA100外，巳设计的检测仪器有Clot Signature Analyser(CSA)、Thrombotic Status Analyser(TSA)、高剪切滤过仪和锥板分析仪。4.2 血小板介导的凝血酶生成 血小板活化时的负电荷磷脂(PF3)提供生成凝血酶的酶和凝血酶原酶，血小板的存在使凝血酶生成量提高5至6个剂量级。此外，GPb/a也可能影响凝血酶原转变成凝血酶，因为存在凝血酶原结合位点。除既往的PF3分析外，新近设计的Hemostatus Device(USA)则是在aPTT试验中加入不同浓度的血小板活化因子，观察凝固时间的缩短。此项试验能鉴定血小板数低70109/L时的出血倾向，血小板无力症，并在GPb/a拮抗剂治疗的监测中有用。4.3 测定凝血块物理特性的仪器 血栓形成动力学中的平衡、收缩和溶解反映了止血栓子进行止血的能力，测定止血时凝块的各种物理特性，人们可获得许多获得性和遗传性血小板的功能缺陷。目前巳商品化的仪器有：血栓弹力图(thromboelastography,TEG)和测量血小板收缩力(platelet contract