微生物的认识.doc

实验一 微生物的认识（3学时）一、实验目的1、掌握显微镜的使用和保养方法2、了解显微镜的基本原理和细菌形态3、建立无菌概念二、实验内容1、学习显微镜的使用和保养2、观察细菌的染色装片3、微生物检查三、显微镜的结构和使用保养（一）显微镜的构造普通光学显微镜机械系统和光学系统两部分组成。1、显微镜的机械系统（1）镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。（2）镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。（3）物镜转换器 Motic显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。（4）载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。（5）推进器 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。（6）粗调螺旋 粗动螺旋是移动载物台调节接物镜和标本间距离的机件，右手向前扭载物台下降，让标本远离物镜，反之则上升，标本接近物镜。（7）微调螺旋 用粗调螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微调螺旋做进一步调节。微调螺旋每转一圈镜筒移动0.1毫米（100微米）。2、显微镜的光学系统（1）集光镜 卤素灯泡（12V/20W），配有电流调节螺旋通过，调节电流大小调节光照强度。（2）聚光器 由阿贝聚光透镜（数值孔径1.25）、虹彩光圈和升降螺旋组成的。阿贝聚光器在物镜数值孔径高于0.6时会显示出色差和球差。聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在0.81.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。（3）物镜 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。物镜的性能取决于物镜的数值孔径（numerical apeature简写为NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜的性能越好。物镜的种类很多，可从不同角度来分类：根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：干燥系物镜 以空气为介质，如常用的40以下的物镜，数值孔径均小于1。油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜，其放大率为90100，数值孔值大于1。根据物镜放大率的高低，可分为：低倍物镜4/0.1， 物镜视场：4.5mm；中倍物镜10/0.25； 物镜视场：1.8mm；高倍物镜40/0.65； 物镜视场：0.45mm；油浸物镜100/1.25 物镜视场：0.18mm； 根据物镜像差校正的程度来分类可分为：消色差物镜 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。平场物镜(Plan)。（4）目镜10/18（后一数字表示视场数）目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安置目镜测微尺。物镜视场 视场数/物镜的放大倍数（二）显微镜的性能显微镜分辨能力首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。1、数值孔径 也叫做镜口率（或开口率），简写为N.A，在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，与镜象亮度的平方根成正比。数值孔径可用下式表示：N.A=n.sin2式中：n物镜与标本之间的介质析射率物镜的镜口角所谓镜口角是指从物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度。镜口角总是小于180。因为空气的折射率为1，所以干燥物镜的数值孔径总是小于1。几种物质的介质的折射率如下：空气为1.0，水为1.33，玻璃为1.5，甘油为1.47，香柏油为1.52。2、分辨力D可用下式表示：D=/2N.A.可见光的波长为0.40.7微米，平均波长为0.55微米。若用数值孔为0.65的物镜，则D=0.55微米/20.65=0.42微米。这表示被检物体在0.42微米以上时可被观察到，若小于0.42微米就不能视见。如果使用数值孔径为1.25的物镜，则D=2.20微米。凡被检物体长度大于这个数值，均能视见。由此可见，D值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。3、放大率：显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）的乘积，即：V=V1V24、焦深：在显微镜下观察一个标本时，焦点对在某一象面时，物象最清晰，这象面为目的面。在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物象滑过而找不到。(三) 显微镜的使用操作及注意事项1、观察前的准备显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地将显微镜搬运到实验桌上。将显微镜放在自己身体的左前方，离桌子边缘约5cm左右，右侧可放记录本或绘图纸。2、低倍镜观察 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定检查的位置。将标本片放置在载物台上，用标本夹夹住，移动推动器，使被观察的标本处在物镜正下方，转动粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观察并同时用粗调节旋钮慢慢升起镜筒（或下降载物台），直至物像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止。用推动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到视野中央进行观察。3、高倍镜观察 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的，在正常情况下，高倍物镜的转换不应碰到载玻片或其上的盖玻片。若使用不同型号的物镜，在转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后从目镜观察，调节光照，使亮度适中，缓慢调节粗调节旋钮，使载物台上升（或镜筒下降），直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野中央进行观察。4、油镜观察 油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。使用油镜按下列步骤操作：1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出，4倍物镜对准光路。2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。4、从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作。5、观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份）或二甲苯，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭23下即可，（注意向一个方向擦拭）。6、将各部分还原，转动物镜转换器，4倍物镜对准光路，载物台下降至最低，降下聚光器，用柔软纱布清洁载物台等机械部分，整理电源线，罩上显微镜罩，然后将显微镜放回。四、细菌染色装片观察1、观察顺序：低倍镜（中央）高倍镜（中央）油镜2、绘图（1）油镜下观察到的图像；（2）在图像下注明菌种名称，后面括号内注明放大倍数。五、微生物检查1、实验室空气：打开培养皿盖，暴露1小时。37C倒置培养2天后观察。2、人体表面（1）手指表面：火焰旁用手指在培养基表面轻按一下。37C培养2天后观察。（2）头发：在培养基上放置1-2跟头发。37C培养2天后观察。六、实验报告要求（略）实验二 细菌染色观察（2学时）一、实验目的1、巩固显微镜的使用和细菌的涂片方法2、掌握细菌的单染色和革兰氏鉴别染色技术二、实验内容1、细菌单染色2、革兰氏染色三、原理用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。染色种类：简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。复染色是用两种或两种以上的染料，常用于鉴别微生物，如革兰氏染色、芽孢染色和抗酸染色等。负染色：使微生物背景着色，如细菌荚膜染色。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。四、操作（一）单染色1、涂片（直径1厘米左右）；2、干燥：自然干燥或在酒精灯上方；3、热固定：使细胞质凝固，杀死微生物，固定细胞形态，使细胞固定在载玻片上。涂菌面朝上，通过火焰23次，涂片反面以不烫手为宜，温度过高会破坏细胞形态；4、染色：约2分钟，期间不要使染液干涸；5、水洗：不要直接冲洗涂面（滴下水无色为止）；6、干燥：自然干燥或吸水纸洗干（不要擦掉菌体），完全干燥后镜检。（二）革兰氏染色1、涂片：混合涂片2、晾干：同简单染色法。3、固定，与简单染色法相同4、结晶紫色染色：加适量（以盖满细菌涂面）结晶紫染色液染色1分钟。5、水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。6、媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。7、水洗：用水洗去碘液。8、脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2025s至载玻片下沿流出液无色，立即水洗。9、复染：滴加蕃红复染2min。10、水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。11、晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。12、镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。革兰氏阳性菌：染成蓝紫色；革兰氏阴性菌：染成（浅）红色注意事项1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。2.涂片过厚，可造成脱色不完全而成假阳性。3、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。4、菌龄：G+菌如白葡萄球菌，培养时间不超过24h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。实验报告1、绘出革兰氏染色两种细菌的形态图，注明染色结果；2、回答相关思考题。思考题：1、固定的作用，应注意那些问题？2、为何制片完全干燥后才能用油镜观察？3、革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？实验三 细菌特殊结构一、实验目的1、掌握细菌芽孢的染色方法2、了解常用的几种特殊染色在微生物形态分类中的重要性二、实验内容1、细菌的芽孢染色三、原理细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。四、操作Schaeffer-Fulton氏染色法1、制片按常规涂片、干燥、固定涂片应偏向载玻片一端，取菌不宜太少，因部分或大部分菌芽孢未形成2、染色：（1）加数滴5%孔雀绿染液于涂片处（染料以铺满涂片处为度），用竹夹夹住载玻片一端，在酒精灯火焰上加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热时温度不能太高，期间要随时添加染液，切勿让标本干涸。（2）水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水无色为止。（3）复染：用蕃红液染色2min。（4）水洗后晾干或吸干。（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。染色结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。五、实验报告1、绘图表示芽孢杆菌的形态特征，注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊形状。2、回答思考题P33（3）。实验四 放线菌形态观察（2学时）一、实验目的1、了解放线菌的形态结构2、学习放线菌的观察方法二、实验原理放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。紧贴固体培养基表面或深入培养基内部生长的叫基内菌丝（基丝），基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝（气丝），并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产基丝而无气丝。光镜下直接观察时，气丝在上层，较粗且色暗，基丝在下层，较细且较透明。孢子丝依种类不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。油镜下观察，孢子有各种形状。扦片法：将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时，用镊子取出盖玻片放在洁净的载玻片上直接观察。三、实验内容1、观察插片法培养放线菌的形态结构2、观察放线菌装片三、操作步骤1、扦片培养（教师提前做好）2、镜检 用镊子小心拔出盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦掉，然后将有菌的一面朝上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。注意：光线宜暗些便于观察。3、染色装片观察。四、实验报告绘图说明所观察到的放线菌的主要形态。实验五 霉菌的形态观察（2学时）一、实验目的1、了解霉菌的形态结构2、学习霉菌的观察方法二、实验原理霉菌菌丝也分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。许多分枝的菌丝相互交织在一起称菌丝体。霉菌菌丝的直径比放线菌约粗几倍到十几倍，用低倍镜即可观察。用乳酸石炭酸棉蓝染液制成的制片特点是：细胞不变形；具防腐作用，不易干燥，可长时间保存；能防止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差，便于观察；必要时用树胶封固制成永久装片。 三、实验内容1、霉菌的直接制片观察2、根霉、毛霉、曲霉、青霉的装片观察四、操作步骤1、直接装片观察（1）根霉、毛霉、曲霉、青霉25天马铃薯琼脂培养物（教师准备）。（2）在载玻片上加一端乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50乙醇浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的溶液中，用解剖针小心将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。2、染色装片观察在低倍镜下（必要时换高倍镜） 观察根霉、毛霉、曲霉、青霉的染色装片。五、实验报告绘图说明四种霉菌的形态特征。实验六 酵母菌形态观察及死活细胞鉴别（2学时）一、实验目的1、了解酵母菌的形态和无性繁殖方式2、掌握活细胞染色观察微生物的方法二、实验内容1、酵母菌的活细胞染色2、压滴法观察统计酵母菌的死亡率三、原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，大多数酵母以出芽方式行无性繁殖，有的分裂繁殖，有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。美蓝是一种无毒性的染料，其氧化型呈蓝色，还原型为无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，因细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，故可通过美蓝染色来鉴别酵母菌是死细胞还是活细胞。四、操作1、在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环取少许少量酵母菌苔放在溶液中，混合均匀。注意取液不要过多或过少，防止溢出或产生气泡。2、用镊子取一块盖玻片，先将其一边与菌液接触，然后慢慢放下使其盖在菌液上。注意不能平着放下，以免产生气泡，如菌液太多，可用滤纸吸去多余菌液。3、将制片放置约3分钟后镜检，遵循先低倍镜而后高倍镜的顺序观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区分死活细胞。依据下式计算死亡率（一个视野）：死亡率（）死细胞数/细胞总数100芽出率（）出芽细胞数/细胞总数100 （不作统计） 肝糖拉观察：将一滴碘液置于载玻片中央，挑少许酵母菌苔，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的肝糖粒呈深红色。 注意须在营养丰富培养基上培养的酵母，在光镜下观察到的是一片红色。五、实验报告1、绘制所观察到的酵母菌形态图实验七、微生物大小测定（3学时）一、实验目的掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法二、微生物大小测定原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0m（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。三、实验内容1、目镜测微尺的标定2、酵母菌的测定四、操作1、目镜测微尺安装将目镜测微尺刻度朝下放在镜筒内隔板上，旋上目镜透镜，插入镜筒内（已装）。2、镜台测微尺刻度面（数字）朝上，置于载物台上。3、校正先用低倍镜观察，调节焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推进器，使两尺在某一区域内两线完全重合，分别数出两重合刻度线之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。然后由下列公式算出目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（m）两重合线间镜台测微尺格数10 两重合线间目镜测微尺格数将目镜测微尺标定结果填入后面表格（1）中。注意：（1）镜台测微尺有刻度一面须朝上放置，如放反无法对焦。 （2）视野必须暗些，否则难找到镜台测微尺的刻度线。 （3）换高倍镜和油镜时要小心，防止与镜台测微尺碰撞损坏镜头。4、菌体大小测定（1）水浸片的制做（2）酵母菌的测量（长径短径）（3）要测定10个细胞并且在读数时估读半个格。将镜台测微尺和菌体测定结果填入相应的表格中。 五、实验报告1、目镜测微尺的校正结果；2、菌体的测量结果；3、回答P51思考题（1）、（2）。实验八、微生物数量测定（3学时）一、原理测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中格（中格用三线隔开），而每个中格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中格（中格之间用双线分开），而每个中格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。细胞数/ml 80小格内的细胞数/80400100010菌液稀释倍数。二、操作1、取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。3将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，由盖玻片的下边缘摘入一小滴，让菌悬液沿缝隙靠毛细渗透作用进入计数室，勿使气泡产生，4静置约5分钟，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数室，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度，否则不易看清计数室方格线。5计数室由25个中格组成，除了要数四个角上中格内的菌数外，还需数中央l个中格的菌数（即80个小格）。如菌体位于方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。6每个样品重复计数23次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作）。7计数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。三、实验报告1、报告计数结果2、回答P56思考题（1）。实验九 培养基的制备及消毒灭菌（4学时）一、实验目的学习掌握微生物培养基的配制方法，学习掌握各种灭菌操作技术。二、实验内容1、LB培养基的配制及灭菌2、基本培养基的配制及灭菌3、玻璃器皿的包扎及灭菌三、操作步骤（一）培养基配制1、液体LB培养基P246（1）50mL2瓶/组（使用150mL三角瓶中），封口膜封口，包扎。（2）5mL1支/组试管2、LB固体平板2个/组3、基本培养基（P116）（1）液体基本培养基50mL1个/组三角瓶（洗涤用）50mL1个/组三角瓶（含氨苄青霉素4060g/mL）（事先配制0.1%氨苄青霉素溶液，灭菌后冷至50左右加入）（2）基本培养基固体平板2个/组（二）其它试剂配制1、PB缓冲液（P120）200 mL/组（分装三角瓶）2、20种氨基酸混合液5 mL/组（试管）3、内装9mL无菌水试管4支/组（稀释备用）（三）玻璃器皿的包扎1、1mL移液管4支/组（稀释用）2、5mL移液管2支/组3、2mL移液管1支/组4、0.2mL移液管30支5、玻璃棒1支/组6、培养皿10个7、50mL1个/组离心管（套管和盖子分别）包扎8、5mL1个/组离心管（套管和盖子分别）包扎9、磁力搅拌转子（单独包扎）10、玻璃涂棒、镊子若干把11、枪头（四）灭菌1、干热灭菌2、高压蒸汽灭菌 注：一组配制液体LB培养基；二组配制固体LB培养基；三组配制液体基本培养基；四组配制固体基本培养基；五组配制PB缓冲液；六组玻璃器皿的包扎。实验十二 大肠杆菌营养缺陷型的筛选一、 实验目的了解微生物诱变育种的基本方法，重点掌握紫外线在诱变中的应用以及营养缺陷型的诱变、浓缩、分离筛选与鉴定的方法。二、 实验材料大肠杆菌（E.coli）斜面菌种。细菌基本培养基、LB培养基（固体和液体）、PB缓冲液（pH7.0）、氨苄青霉素、氨基酸混合液。台式离心机、多用振荡器、磁力搅拌器、紫外灯（30W）等。三、 实验步骤（一） 细菌悬液的制备取一环大肠杆菌（E.coli）斜面菌种接入装有5mLLB液体培养基的试管中，37，200r/min培养12-16h,(观察生长情况酌情延长时间)（4保存）。摇匀，取上面培养液0.5mL，接入含有50mLLB液体培养基的三角瓶中，37，200r/min培养2-4h，将培养液转移到离心管中，（用三角瓶中剩余的残液进行细胞计数），盖上离心机盖子，平衡（称重）后离心（3000r/min,10min），弃上清液，菌体用约20mL PB洗涤，离心，弃上清液，再用一定量的PB悬浮细胞，使细胞浓度控制在107-108/mL。注：洗涤前的细胞数量除以107-108/mL即得稀释倍数。（二） 诱变处理（红灯下操作）在超净工作台下用5mL无菌吸管取上述悬浮液5mL于直径6cm培养皿中，用镊子放入搅拌子，将培养皿放在磁力搅拌器上，在搅拌状态下（勿打开搅拌器加热旋钮）接受紫外线照射9min，照射完毕立即离心，弃上清液，注入2mLPB缓冲液，用玻棒搅动悬浮细胞，黑塑料袋包裹避光4保存（也可直接进行下面操作而不保存）。 （三）营养缺陷型的浓缩将上述处理过的细菌悬液接入(直接倒入)50mLLB液体培养基中，37，200r/min避光培养2-4h（观察生长情况，可以酌情延长），离心收集细胞，并用基本培养基洗涤两次，然后用4mL基本培养基悬浮细胞（4保存）。用无菌吸管取2mL细胞悬液接入50mL（内含氨苄青霉素）基本培养基中， 37，200r/min培养3-4h（4保存）。计数，离心（操作同前），用PB洗涤一次，再用一定量的PB制成细胞悬液（使细胞浓度控制在102个/mL），吸取0.2mL，涂布LB固体平板，静置片刻后37，倒置培养12-16h（4保存）。（四）营养缺陷型的挑选和鉴定吸取0.2mL 氨基酸混合液到固体基本培养基平板上，用玻棒涂平制成含20种氨基酸基本培养基。将LB平板上形成的每个菌落用用接种针分别点种在基本培养基和含氨基酸基本培养基上（次序位置不可混淆，每点种一个菌落接种针须灭菌一次），37培养1216h。在基本培养基上不生长而在含氨基酸基本培养基相应位置生长的菌落即可确定为氨基酸营养缺陷型。四、 注意事项1、 操作的各环节要无菌操作。2、 培养箱及离心机等仪器设备用后如实填写使用记录。实验十 乳酸发酵及成品中乳酸菌的检测（6学时）一、实验目的了解发酵的一般原理，学习酸奶制作，掌握活菌计数方法，并对酸奶中微生物进行检测二、实验原理酸奶是以脱脂乳粉或牛奶为原料，经乳酸菌发酵而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品。奶中的乳糖经乳酸菌发酵产生乳酸使得pH下降，当pH下降到4.7以下时，牛奶中的酪蛋白发生凝固而使奶液成凝乳状态（牛奶中含蛋白质大约为3，酪蛋白占其总量的85，等电点是4.7）在发酵过程中还产生一些风味物质，如乙醛、二乙酰等，这些风味物质与加入的蔗糖共同构成酸甜可口，具有独特口味的酸奶。酸奶按照凝固状态分为凝固型酸奶和搅拌型酸奶。三、实验内容1、酸奶制作2、酸奶中乳酸菌的检测四、实验步骤（一）酸奶制作1、培养基制备取6000 ml鲜牛奶，加入蔗糖使成浓度6，在85下灭菌10min，冷却至42。2、接种 倒入市售酸奶600 ml，接种量10。3、分装 灭菌后奶瓶，每瓶装量约200ml，封口，橡皮筋捆扎。4、发酵 前发酵，4243，36h，凝乳后转入后发酵。25，1224h。5、品尝鉴定从凝乳情况、口感、香味和异味等方面给予评价。（二）乳酸菌检测1、改良MC培养基制备蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，碳酸钙10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，1%中性红溶液5mL。将上述7种成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6，加入中性红溶液。分装6个三角瓶，121灭菌20min。临用时加热熔化琼脂，冷至50备用。2、其它所需物品培养皿 5个/组移液管 1mL12支 3支 /组，装无菌水9mL试管，1支 /组，装无菌水9mL试管，9支/3组。含225mL无菌水的三角瓶一个，分装，灭菌。不锈钢样杓一个，包扎灭菌。3、操作步骤（1）熔化培养基，50保温备用。（2）无菌操作称取25g样品放入含225mL无菌水的三角瓶中制成101菌悬液（全班做一个）。（3）用1mL灭菌吸管吸取上述菌悬液沿管壁徐徐注入含有9mL无菌水试管中，（注意管尖不要接触管内液体），摇匀（以后每次稀释都要注意），制成102菌悬液；（4）另取一支1mL灭菌吸管吸取102菌悬液，按上述操作次序，作10倍递增稀释液，每次换用一支吸管。如此反复，制成104菌悬液，（3）和（4）每两个小组做一个。（5） 稀释倒平板（以小组为单位） 分别吸取103和104两个稀释度的菌悬液1mL注入培养皿中，然后将冷至50的培养基倒入约15mL，转动培养皿混匀，每个梯度做两个平皿，另外一个培养皿用无菌水作对照。待琼脂凝固后倒置培养。（6）培养温度36,72h取出，菌落计数。4、结果计算 假如103的平板菌落数为30个，则1g酸奶中乳酸菌的数量为： 30103 3104个/g3、实验九 环境微生物的分离纯化（6学时）一、实验目的1、学会微生物培养基的配制方法2、学习并掌握各种无菌操作技术3、学会从菌落及培养特征区分细菌、放线菌和霉菌二、实验原理土壤是微生物的大本营，所含微生物的数量和种类都极为丰富，是微生物多样性的重要场所，也是发掘微生物资源的重要基地。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法是平板分离法。平板分离法一般是根据微生物对营养、酸碱度、温度和氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某些抑制剂，造成抑制其它微生物生长而有利于该微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。再用稀释涂布法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直至获得一种纯培养。三、实验内容1、牛肉膏蛋白胨、高氏1号和马丁氏培养基的配制及灭菌。2、分离土壤中的细菌、放线菌和霉菌，菌落计数3、平板划线法分离纯化微生物4、微生物菌落及培养特征观察三、时间安排1、培养基配制及灭菌（2小时）2、土壤悬液的制备、倒平板及涂布（2学时）3、划线分离挑菌落（2学时）实验十 培养基的制备及消毒灭菌一、实验原理（略）二、培养基配制（一）牛肉膏蛋白胨培养基1、称药品（一组配1000毫升，另一组配500毫升）2、溶化将上述药品放入搪瓷缸中，加入少于需要量的水，溶化后补足水。3、调pH4、分装：一组分装试管，装量不超过试管高度的1/5，另一组分装三个500毫升锥形瓶。5、加棉塞及包扎，注明培养基名称、组别和日期。6、灭菌：0.1MPa，121、20分钟。7、摆斜面。8、无菌检查 37温箱培养24h，无菌生长即可使用。（二）高氏1号培养基1、称量和溶化（一组配1000毫升，另一组配500毫升）称取的可溶性淀粉先放入小烧杯中，用少量冷水调成糊状，再加至少于所需要水量的沸水中，继续加热，直至淀粉完全溶化，再将其它成分依次逐一溶化。1%FeSO47H2O（教师配制）加量（1ml/1000ml培养基）2、其余步骤同牛肉膏蛋白胨培养基配制。（三）马丁氏培养基1、一组配1000毫升，另一组配500毫升2、链霉素的加入，链霉素受热易分解，故临用时，将培养基溶化后待温度降至55左右时再加入。可先配制成1的溶液（保存于20），加量为0.3 ml/100ml培养基。3、其余步骤同牛肉膏蛋白胨培养基配制。二、其它器皿的准备1、试管，内装无菌水9.0毫升，4只管/每5人组；2、50毫升锥形瓶，内装无菌水49.5毫升（铺满玻璃珠）3、2.0毫升移液管5只/每5人组（示范加棉塞）。4、培养皿15套/每5人组5、玻璃涂布器实验六（二）土壤微生物的分离纯化一、土壤悬液制备1、土样0.5g，倒入带玻璃珠的锥形瓶中，振荡510分钟，即成102悬液。2、无菌吸管编号，104、105、106，用无菌吸管吸取1ml 102悬液，放入装有9.0ml无菌水试管中，即成103悬液，混匀，如此重复，可制成103106悬液。二、倒平板1、加热溶化（教师提前做），冷至55左右，高氏1号加入10酚数滴，马丁氏培养基加入链霉素溶液（加量为0.3 ml/100ml培养基），混匀后倒平板。2、倒平板无菌操作（示范）。3、贴标签（皿底边缘），注明培养基名称，稀释度，组别和日期。三、涂布将0.1ml菌悬液滴在平板中央位置（管尖端的剩余液体需在培养基表面轻轻按一下便可），右手用无菌涂棒将菌悬液均匀涂布。四、培养高氏1号和马丁氏培养基倒置于28培养箱中培养35天，肉膏蛋白胨培养基倒置于37培养箱中培养23天。五、平板划线分离（安排在课间）1、描述三种平板上细菌、放线菌和霉菌菌落的特征。2、划线分离，每人做一个（注明姓名，日期，培养基名称）。挑取单个菌落，在相应的平板上划线分离。划线方法见P73图6。3、培养过程同上。附：菌落特征描述：1、质地：致密/疏松；湿润，粘稠，干燥；透明/不透明；光滑/粗糙； 正反面颜色（一致/不一致）；与培养基结合的紧密程度（易挑/不易挑取）。 2、形态：大小，厚薄，圆形，不规则等。 3、隆起（程度）：扁平，凸透镜状，脐状突起等。 4、边缘特征：整齐，波状，齿状等。实验九 细菌的生理生化反应（6学时）一、实验目的1、学习并掌握细菌鉴定中常用的生理生化反应2、熟练微生物无菌操作技术二、实验原理各种细菌所具有的酶系统不同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。1、糖发酵试验不同的细菌含有发酵不同糖的酶，因而发酵糖的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫pH52(黄色)一68(紫色)，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。2、吲哚试验某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质(吲哚)，靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚(红色化合物)。3、甲基红试验(MR试验)很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到42以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH44(红色)pH62(黄色)。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱羧，转化成醇等物质，则培养基的pH仍在62以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。4、伏普试验（V.P试验）伏普试验用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。如产气杆菌，可分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下可被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即VP反应阳性；不产生红色化合物者为阴性反应。有时为了使反应更明显，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。三、实验内容1、培养基