蛋白质的测定.docx

蛋白质的化学反应及与食品成分的相互作用1 蛋白质与水的相互作用：蛋白质的水溶性蛋白质与水之间的作用力主要是蛋白质中的肽键（偶极-偶极相互作用或氢键），或氨基酸的侧链（解离的、极性甚至非极性基团）同水分子之间发生了相互作用。影响蛋白质水溶性的应素很多：（1）pHpI 时，蛋白质带负电荷，pH=pI 时，蛋白质不带电荷，pH 时，蛋白质带正电荷。溶液的pH 低于或高于蛋白质的pI 都有利于蛋白质水溶性的增加，一方面是加强了蛋白质与水分子的相互作用，另一方面蛋白质链之间的相互排斥作用。等电沉淀。（2）离子强度：=0.5CiZi2，Ci 表示离子强度，Zi 表示离子价数。盐溶：当溶液中的中性盐浓度在0.5mol/L 时，可增加蛋白质的溶解性，盐作用减弱蛋白质分子之间的相互作用。盐析：当溶液中的中性盐的浓度大于1mol/L 时，蛋白质会沉淀析出，这是盐与蛋白质竞争水分的结果。不同盐类对蛋白质的盐析作用强弱不同。将这种强弱顺序称为感胶离子序： （3）非水溶剂：有些有机溶剂可引起蛋白质变性沉淀，主要是有机溶剂降低了水的介电常数，蛋白质之间的静电斥力降低。（4）温度：温度低于40-50时，随温度的增大水溶性增大，当温度大于50，随温度的增大，水溶性降低。根据蛋白质的溶解性对蛋白质分类：（1）清蛋白：可溶于pH6.6 的水中，血清清蛋白，卵清蛋白，-乳清蛋白；（2）球蛋白：能溶于pH7 的稀碱溶液，-乳球蛋白；（3）醇溶蛋白：能溶于70%的乙醇，玉米醇溶蛋白；（4）谷蛋白：在上述溶剂中都不溶解，但可溶于酸（pH2）或碱（pH12）。2 织构化在许多食品体系中，蛋白质是构成食品结构和质地的基础，无论是生物组织（鱼和肉的肌原纤维蛋白），还是配制食品（如面团、香肠、肉糜等）。还可以通过织构化加工植物蛋白使其具有咀嚼性及持水性的纤维状产品。一般蛋白质织构化的方法有：（1）热凝固和薄膜形成：豆浆在95保持几小时，表面会形成一层薄膜，如腐竹的生产。一般工业化蛋白质织构化是在光滑的金属表面进行的；（2）纤维形成：纤维纺丝。大豆蛋白纺丝：在pH10 时制备高浓度10-40%的纺丝溶液脱气澄清通过管蕊板，每平方厘米1000 孔，孔径为50-150m酸性氯化钠溶液（等电沉淀或盐析）压缩成品。（3）热塑挤压：使蛋白质中的含水量为10-30%，在高压下10000-20000kPa，使其在20-150s 内温度升高到150-200。挤压通过蕊板，一般在蛋白质中加入淀粉可改善其质地。3 凝胶形成：蛋白质形成凝胶的机制和相互作用至今还没有完全研究清楚，但有研究表明蛋白质形成凝胶有两个过程，首先是蛋白质变性而伸展，而后是伸展的蛋白质之间相互作用而积聚形成有序的蛋白质网络结构。影响蛋白质凝胶形成的因素有：（1）蛋白质的浓度：蛋白质溶液的浓度越大越有利于蛋白质凝胶的形成，高浓度蛋白质可在不加热、与等电点相差很大的pH 条件下形成凝胶。（2）蛋白质的结构：蛋白质中二硫键含量越高，形成的凝胶的强度也越高，甚至可以形成不可逆凝胶，如卵清蛋白，-乳球蛋白。相反含二硫键少的蛋白质可形成可逆凝胶，如白明胶等。（3）添加物：不同的蛋白质相互混合，可促进凝胶的形成，将这种现象称为蛋白质的共凝胶作用。在蛋白质溶液中添加多糖，如在带正电荷的明胶与带负电荷的褐藻酸盐或果胶酸盐之间通过离子相互作用形成高熔点凝胶。（4）pH：pH 在pI 附近时易形成凝胶。4 面团形成小麦胚乳中的面筋蛋白质在当有水分存在时在室温下混合和揉搓能够形成强内聚力和粘弹性糊状物的过程。水合的面粉在混合揉搓时，面筋蛋白质开始取向，排列成行或部分伸展，这样将增强蛋白质的疏水相互作用并通过二硫交换反应形成二硫键。最初的面筋颗粒形成薄膜，形成三维空间上具有粘弹性的蛋白质网络。影响蛋白质面团形成的因素有很多：（1）氧化还原剂：还原剂可引起二硫键的断裂，不利于面团的形成，如半胱氨酸；相反氧化剂可增强面团的韧性和弹性，如溴酸盐；（2）面筋含量：面筋含量高的面粉需要长时间揉搓才能形成性能良好的面团，对低面筋含量的面粉揉搓时间不能太长，否则会破坏形成的面团的网络结构而不利于面团的形成；（3）面筋蛋白质的种类：利用不同比例的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白进行实验，发现麦谷蛋白决定面团的弹性、粘结性、混合耐受性等，而麦醇溶蛋白决定面团的延伸性和膨胀性。5 乳化性质蛋白质在许多乳胶体食品体系中起着重要的作用，如牛奶、冰淇淋、肉馅等。蛋白质对水/油体系的稳定性差，而对油/水体系的稳定性好。影响蛋白质乳化的因素：（1）盐：0.5-1.0mol/L 的氯化钠有利于肉馅中蛋白质的乳化；（2）蛋白质的溶解性：蛋白质的溶解性越好，其乳化性也越好，但蛋白质的乳化性主要与蛋白质的亲水-亲油平衡性有关；（3）pH：有些蛋白质在pI 时乳化性最好，而有些蛋白质在pI 乳化性最差；（4）热作用：热不利于蛋白质乳化性的发挥。6 起泡性质在食品体系中蛋白质起泡的现象非常常见，如蛋糕、棉花糖、蛋奶酥、啤酒泡沫、面包等。蛋白质泡沫其实质蛋白质在一定条件下与水分、空气形成的一种特殊形态的混合物。影响蛋白质起泡的因素有：（1）盐类：氯化钠一般能提高蛋白质的发泡性能，但会使泡沫的稳定性降低，Ca2+则能提高蛋白质泡沫的稳定性。（2）糖类：糖类会抑制蛋白质起泡，但可以提高蛋白质泡沫的稳定性。（3）脂类：脂类对蛋白质的起泡和泡沫的稳定性都不利。（4）其他：蛋白质浓度为2-8%时，起泡效果最好，除此之外还与搅拌时间，强度、方向等有关。有时由于蛋白质的起泡而影响加工工艺的操作，要对蛋白质泡沫进行消除，常用的方法就是加入消泡剂硅油。7 风味结合作用蛋白质可以使食品中的挥发性风味化合物在贮藏及加工过程中不发生变化，并在进入口腔时完全不失真的释放出来。影响蛋白质风味结合作用的因素有：（1）水：水可以提高蛋白质对极性风味化合物的结合作用，但对非极性风味化合物的结合没有影响；（2）盐：凡能使蛋白质解离或二硫键断裂的盐类，都能提高蛋白质的风味结合能力；（3）水解作用：蛋白质水解后其风味结合作用严重被破坏；（4）热变性：热变性一般会使蛋白质的风味结合作用有所加强；（5）其他：脱水，脂类存在。蛋白质的测定方法pro的测定方法分为两大类：一类是利用pro的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。但是食品种类很多，食品中pro含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此pro的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。一 凯氏定氮法这种方法是1883年Kjeldahl发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解试样，而不能阐明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用H2SO4分解试样，需要较长时间，后来由Gunning加入改进，他改进的办法是在消化时加入K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的380上升到400，提高了不到67所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用。我们在检验食品中pro时，往往只限于测定总氮量，然后乘以pro核算等数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。1 凯氏常量定氮法：不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的，首先第一个步骤是消化：（1）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而pro则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。（2）在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330，而添加硫酸钾后，温度可达400，加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。（1）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。（2）吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。 1操作步骤：准确称取样品中0.50-2.00g于500ml凯氏瓶中加10g无水K2SO4加0.5gCuSO4加20ml H2SO4在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中继续消化30分钟至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却加200ml水连接蒸馏装置用硼酸作吸收液在K氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH立即接好定氮球加热至到K氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗用0.1N HCl滴定。N（V2-V1）0.014W计算：总氮量%= （N(V2-V1)0.014）/W 1000.014-氮的毫克当量数pro%=总氮%K乳制品K=6.38（N=15.7%）小麦粉K=5.79（N=17.6%）动物胶K=5.6（N=18.0%）冰蛋K=6.7（N=14.8%）大豆制品K=6.0（16.7%） K=6.25则（N=16%） K-换称等数各种试剂的作用:浓H2SO4：A ：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将H2SO4还原为SO2，本身则变为CO2B： 氧化C： pro与浓H2SO4生成NH3，CO2，SO2，H2OD： NH3与H2SO4生成硫酸铵（1）CuSO4的作用（催化剂）CuSO4为红色沉淀，当C完全消化后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全，兰色为CuSO4的颜色（2）K2SO4的作用（提高沸点）沸点由330提高到400加速了反应过程。（3）硒粉和过氧化氢，氧化汞都为催化剂，但为了防止污染通常采用硫酸铜（4）50%NaOH的作用下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素:（1）K氏烧瓶和取样量如果称1g以上的样品，就需要K氏烧瓶最小500ml，8001000ml的更好，这样的K氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。（2）分解剂A H2SO4和K2SO4的添加量有机无分解需要H2SO4量，H2SO4应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和H2SO4的添加比例是：1g样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml这种比例在国内外都使用，是公认的还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20mlB 催化剂用作催化剂的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，对Hg，HgO有毒但结果好，Se与CuSO4得到结果是一种，TiO2，的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同， HgO消化麦子为38，Se与CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子70，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。（3）热源的强度消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致H2SO4损失，使氨回收率低，另外K氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。（4）氨的蒸馏和吸收及滴定蒸馏有两种:1 直接蒸馏（装置简便，准确性好）2 水蒸汽蒸馏蒸馏加NaOH是50%，加的量为H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则NaOH为124=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到5055ml，如果NaOH量加的不够就变成H2S， H2S是强酸，使颜色变红。吸收液有：1标准H2SO4 用标准碱返滴定，甲醛红指示剂2 硼酸 用HCl进行滴定，混合指示剂目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%。6实验注意事项a.样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。b.样品放入K氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。c.消化时，如不容易呈透明溶液，可将K氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化剂23ml，促使氧化。d.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在K氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。e.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。f.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。g.氨是否完全蒸馏出来，PH试纸检查馏出液是否为碱性。h.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀无。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。i.消化剂绿色后继续消化30分钟即可。2 K氏微量定氮仪法3 K氏半微量定氮仪法 (2 、 3原理一样)操作方法大同小异，半微量法消化后，定容100ml，然后吸25ml蒸馏吸收液吸收。N（V2-V1）0.014W计算总氮%=(N(V2-V1)0.014)/(W10/100)100 对于微量定氮仪法，仪器有了改进，样液称样少，蒸馏消化液也少，其它基本一样。4 K氏自动定氮法原理与上面一样，仪器，采用K氏自动定氮仪：其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的K氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。二 水扬酸比色法：1 原理： 样品中的pro经H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。2 方法 （）标准曲线的绘制取6个25ml容量瓶编号 0 1 2 3 4 5 6分别加空白酸液 2ml 分别加磷酸盐缓冲液 5ml稀释至总体体积至15ml 分别加水扬酸钠 5ml37C水浴 15分钟加入次氯酸钠 2.5ml37C水浴 15分钟取出试液于660nm下进行比色，绘标准曲线。（2）样品处理：准确称样0.201.00g于K氏瓶中加15mlH2SO4和5g催化剂电炉上加热到沸腾后加大火力消化直到出现暗绿色时摇动瓶子K氏瓶全部消化后冷却加水至250ml容量瓶。（3）样品测定：准确吸取上述消化溶液10ml于100ml容量瓶中定容准确吸2ml于25ml容量瓶中加5ml磷酸缓冲液以下操作与标准曲线绘制的步骤相同并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。（4）计算CF含氮%= - 100W10001000 C-从标准曲线中查出测定样液的含氮量（Ug）F-样品溶液的稀释倍数W-样品重量（g）pro%=总氮%K（K可为6.25，也可查）3注意事项：A 当天消化液最好当天测定，结果重现性好，如果样液改至第二天比色就有变化。B 当在PH和试剂适当范围内加入氯源后，颜色的显色和温度有关，应严格控制反应温度。C 这种方法测定结果基本与K氏法一致。4 试剂（1）氯标液：称经110干燥2h的硫酸铵0.4719g于烧瓶中定容10ml此液1ml相当于1.0mg氮标液使用时配制成1ml相当于2.50Ug氮标液。（2）空白酸液：称0.50g蔗糖加15mlH2SO4和5g催化剂与样品一样消化定容250ml使用时吸收此液10ml加水至100ml为工作液备用。（3）磷酸盐缓冲液：称7.1g磷酸氢二钠加38g磷酸三钠加20g三九石酸钾钠加400ml水溶解过滤另称35gNaOH溶于100ml水中冷至室温缓缓地搅拌加入磷酸盐溶液中加入水稀释至1000ml备用。（4）水扬酸钠溶液：称25g水杨酸钠和0.15g亚硝基铁氰化钠溶于200ml水中过滤，加水稀释至500ml（5）次氯酸钠溶液：吸4ml安替富民液，用水稀释至100ml5 仪器（1）分光光度计（2）恒温水浴三 紫外分光光度法1 原理：pro及其降解产物的芳香环基 ，在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在280nm下，光吸收与pro浓度（38mg/ml）成直线关系，因此，通过测定pro溶液的吸光度，并参照事先用K氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量。2 试剂：（1） 0.1mol/l柠檬酸水溶液。（2）8mol/l脲（NH2）2CO的2NNaOH溶液。 脲的2N氢氧化钠液（3） 95%乙醇（4） 无水乙醚3 仪器（1） 751型的紫外分光光度计（2） 离心机4 操作方法（1）标准曲线的绘制：准确称取样品.2.00g，置于50ml烧瓶中，加入0.1mol/l柠檬酸水溶液30ml，搅拌30分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以每秒钟30005000转的速度离心10分钟，分别吸出上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml于6个10ml容量瓶钟，每个容量瓶，8mol/l脲的氢氧化钠溶液充分摇2分钟（如果离心再次离心），取透明液于比色皿中，在280nm下测定其吸光度。（做参比值）以事先用K氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量微横坐标上面的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。（2）样品测定准确称取试样1.00g于50ml烧杯中加0.1mol/l柠檬酸溶液30ml搅拌10分钟四层纱布过滤到离心管中用8mol/L脲的NaOH溶液定容，摇匀后于280nm下测吸光度，从标准曲线上查出pro的含量。计算： 蛋白质= C/W100C-从标准曲线上查得的pro含量（mg）W-测定样品溶液相当于样品量（mg）说明：a.此法运用于糕点，牛乳和可溶性pro样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。b.温度对pro水解有影响，操作温度应控制在2030。四 双缩脲法-皮尼克法1 原理：双缩脲在碱性条件中，能与CuSO4结合成红紫色的络合物。pro分子中含有肽链与双缩脲结构相似，也呈此反应。本法直接用于测定像小麦粉等固体试样的pro含量。但作为铜的稳定剂，酒石酸钾钠比甘油好些。小麦粉中的pro能直接地一边抽出一边进行定量。2 试剂甘油作为稳定剂：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO450ml。酒石酸钠作稳定剂，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到930ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO4液40ml。配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。3 方法：样品测定标准曲线绘制准确称0.6g样品使用试剂（1）准确称0.5g样品使用试剂（2）假如用试剂（2）（1）准确称样0.5g于80ml离心管加1mlClC4混合加50ml酒石酸钾钠稳定剂盖上盖子离心10min（4000转/分）放置1小时吸混合液15ml于20ml离心管中离心到完全透明取上清夜5ml于10ml容量瓶加水定容于550nm处测定吸光度，从标准曲线上查出pro含量。（2）标准曲线绘制按样品测定方法，根据样品中pro含量，取离心澄清样液0.0 2.0 4.0 8.0 10.0ml于10ml容量瓶中分别加水定容，按照样品测定其吸光度。事先用K氏定氮法测定样品中pro含量为横坐标，以上述吸光度为纵坐标绘制标准曲线。4 计算：蛋白质%=C/W100C-从标准曲线上查得得pro含量（mg）W-测定样液时相当于样品重量（mg）氨基酸总量测定蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的pro成分，如水解后的产物经胨，肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成pro最基本的物质。水解后的pro和水解前的pro在物理特性，化学结构以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差别与水解的程度有密切关系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以评价食品的营养价值。氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸（仪器价格昂贵，不能普遍使用），对于食品来说有时有很多种氨基酸可以同时存在于一种食品中，所以需要测定总的氨基酸量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮（氨基酸态氮）的百分率表示，当然，如果食品中只含有一种氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以从含氮量计算出氨基酸的含量。食品在评价蛋白质的营养价值时，除了测定pro的含量，氨基酸氮含量，还需要对各种氨基酸进行分离，鉴定，尤其对8种人体必需氨基酸进行定量定性分析。一单指示剂甲醛滴定法：1原理：氨基酸具有酸，碱两重性质，因为氨基酸含有-COOH基，而-COOH基显示酸性，又含有-NH2，-NH2则显示碱性，由于-COOH基和-NH2的相互作用，使氨基酸成为中性的内盐，当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，其碱性消失，破坏内盐的存在，就可用碱来滴定-COOH基，以间接方法测定氨基酸的量，反应式以三种形式存在。用碱完全中和-COOH基时的PH值为8.49.2。2试剂：（1）40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，将甲醛用1N NaOH溶液中和（淡兰色）。（2）0.1%百里酚酞乙醇溶液。（3）0.100N NaOH标准溶液。3操作步骤：称约含20mg左右的氨基酸于烧杯中（如为固体样加水50ml）加两滴指示剂用0.1N NaOH溶液滴定到淡兰色加中性甲醛20ml摇匀静置1分钟此时兰色应消失再用0.1N NaOH溶液滴定淡兰色，记录两次滴定所消耗的碱液毫升数。计算：氨基酸态氮=（NV0.014100）/W100二双指示剂甲醛滴定法1原理：与单色法相同，只是在此法中使用了两种指示剂，从分析结果看，双指示剂甲醛滴定法与亚硝酸氮气容量法（此法操作复杂，但准确，不作介绍）相近，单色滴定法稍偏低，主要因为单指示剂甲醛滴定法是以氨基酸溶液的PH值作为中性红的终点，PH值为7.0，从理论计算看，双色滴定法比单色滴定法准确。2试剂：同单指示剂一样，多一个0.1%中性红（50%乙醇溶液）3操作步骤：取相同两份样品分别于100ml三角瓶一份加中性红2滴用0.1N NaOH滴定终点（由红变琥珀色），记录用量，另一份加百里酚酞乙醇液3滴加中性甲醛20ml摇匀用0.1N NaOH 滴至淡兰色。计算：氨基酸态氮=（N（V2-V1）0.014100）/W100V1用中性红为指示剂时，碱液所消耗的体积V2用百里酚酞乙醇液为指示剂时标液消耗量0.014氮的毫克当量浓度注意事项：（1）单色指示剂甲醛滴定法，用碱完全中和COOH基时的pH为8.59.5（2）测定样品的颜色较深，应加活性炭脱色之后再滴定三茚三酮比色法：1原理：氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色法定量测定。2试剂：（1）磷酸缓冲液（pH.8.04）制备方法如下：称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml称NAH2PO412H2O 11.9380g分别溶解定容500ml取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液（2）2%茚三酮溶液：称茚三酮1g溶于35ml热水加入40mg氯化亚锡（SnCl2H2O）搅拌过滤（作防腐剂）于冷暗处过夜定容50ml 氨基酸标液称干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g溶解定容100ml摇匀吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml标液3操作方法：（1）绘制标准曲线：取7个25ml容量瓶，吸取标液 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0ml于7个25ml容量瓶，加水补充至容积为4ml，然后加茚三酮和缓冲液各1ml，于水浴加热15分钟，冷却后定容25ml，静置15分钟，在570nm下测消光值，绘制标准曲线。（2）样品测定：取样品5.0010.0g（液体样5-10ml）于烧杯中加50ml水和活性碳约5g加热过滤用3040ml热水洗涤活性炭吸澄清样液14ml加茚三酮和缓冲液各1ml水浴加热15分钟，冷却定容，静置15分钟于570nm下测定消光值，按下式计算氨基酸含量。氨基酸含量（毫克/100克）=C/（W1000）100C从标准曲线上查得得氨基酸的量（Ug）W测定得样品溶液相当于样品的量（g）注意事项：茚三酮受阳光、温度、湿度、空气等影响易被氧化呈淡红或深红色，使用前要进行纯化，方法如下：、取10g茚三酮容于40ml热水中，加一克活性炭，摇匀静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过滤，即出现兰色结晶，过滤，用2ml冷水洗涤结晶，置干燥皿中干燥，装瓶备用。思考题：1 试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？2 样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？3 硫酸铜及硫酸钾在测定中起了什么作用？4 试述氨基酸态氮的测定原理。5 结果计算中为什么要乘上蛋白质系数？实验：水果中酸度的测定。糕点中和脂肪的测定。窗体顶端窗体底端关于氮-蛋白质换算等数对于氮含量换算成pro含量的等数，历来采用6.25，这个数值是以pro平均含氮而导出的数值，但是食品中含氮的比例，因食品种类不同，差别是很大的，我们在测定pro时，应该是不同的食品采用不同的换算等数，一般手册上列出了一部分换称等数，用时可查，蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麦=5.83，玉米=6.25，小麦=5.83，麸皮=6.31，面粉=5.70，如果手册上查不到的样品则可用6.25，一般在写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。对于用各种原料混合制成的食品，采用占总氮量多的原料为换算等数，对于一些组成成分不明确的食品可采用6.25，我们在作报告时，一定要注明所用的换算等数。近几年，国际组织认为6.25的换算等数太高，特别是对蛋品、肉品及鱼类，贝类等动物性食品，根据以氨基酸组成总量计算的比6.25要低的多，目前还在争论之中，以后很有可能比6.25要小一些。几种常用的蛋白鉴定方法传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。1 图象分析技术（Image analysis）“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。 在一系列高质量的2-DE凝胶产生（低背景染色，高度的重复性）的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。 首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD（charge coupled device）照相机；激光密度仪（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，对图象进行数字化。 并成为以象素（pixels）为基础的空间和网格。 其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。 在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。 以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。 第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。 由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。 IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。 因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。 用来配比的著名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。 配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。 之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW（分子量）的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。 所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。 已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在0。25个单位。 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。 故需联合其他的技术完成鉴定。2 微量测序（microsequencing）蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。 尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱（PMF）可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。 目前已实现蛋白质微量测序的自动化。 首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定。 但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40 min 1个氨基酸的速率产生；与质谱相比，Edman降解消耗大；试剂昂贵，每个氨基酸花费34$。 这都说明泛化的Edman降解蛋白质不适合分析成百上千的蛋白质。 然而，如果在一个凝胶上仅有几个有意义的蛋白质，或者如果其他技术无法测定而克隆其基因是必需的，则需要进行泛化的Edman降解测序。近来，应用自动化的Edman降解可产生短的N-末端序列标签，这是将质谱的序列标签概念用于Edman降解，业已成为一种强有力的蛋白质鉴定。 当对Edman的硬件进行简单改进，以迅速产生N-末端序列标签达1020个/d，序列检签将适于在较小的蛋白质组中进行鉴定。若联合其他的蛋白质属性，如氨基酸组分分析、肽质质量、表现蛋白质分子量、等电点，可以更加可信地鉴定蛋白质。 选择BLAST程序，可与数据库相配比。 目前，采用一种Tagldent的检索程序，还可以进行种间比较鉴定，又提高了其在蛋白质组研究中的作用。3 与质谱（mass spectrometry）相关的技术质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。 用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分，1）样品入机的离子源，2）测量被介入离子的分子量的装置。 首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）为一脉冲式的离子化技术。 它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量。 其次是电喷雾质谱（ESI-MS），是一连续离子化的方法，从液相中产生离子，联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。 近年来，质谱的装置和技术有了长足的进展。在MALDI-TOF中，最重要的进步是离子反射器（ion reflectron）和延迟提取（delayed ion extraction），可达相当精确的分子量。 在ESI-MS中，纳米级电雾源（nano-electrospray source）的出现使得微升级的样品在3040 min内分析成为可能。将反相液相色谱和串联质谱（tandem MS）联用，可在数十个picomole的水平检测；若利用毛细管色谱与串联质谱联用，则可在低picomole到高femtomole水平检测；当利用毛细管电泳与串联质谱连用时，可在小于femtomole的水平检测。 甚至可在attomole水平进行。 目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。 下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。(1)肽质指纹术（peptide mass fingerprint， PMF）由Henzel等人于1993年提出。 用酶（最常用的是胰酶）对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量（MALDI-TOF-M