蔗糖酶的提取及活力.doc

蔗糖酶的提取及活力、含量和相对分子质量测定摘要：本学期共做了六次生化实验。.第一次是提取及纯化蔗糖酶，以为后续实验提供样品。实验主要目的是要求学生掌握高速离心机的使用。实验共得到不同纯化度的三种提取液，标记为A、B、C。将三种提取液分别放入冰箱保存，做为后续实验样品。也因此做此实验时必须保证各个操作无误，及准确，以免影响后续实验的结果。第二次是有关蔗糖酶的柱层析法，主要目的是要求同学掌握离子交换层析的原理及柱层析的操作技术及紫外吸收的分析方法。此次实验通过柱层析及紫外吸收法得到23管的活力最大的分离液合并为分离液D，放入冰箱作为后续实验样品。第三次实验为蔗糖酶的活力测定，目的为掌握酶的活力测定方法，了解各个酶的纯化情况。利用分光度计测出各个样品的OD值，再对照葡萄糖的标准曲线来得出剩余葡萄糖的含量，从而获得各个酶的活力大小，了解各个酶的纯化情况。并得出结论酶的纯化度越高，活力越小。第四次实验为蔗糖酶蛋白质的含量测定，目的为掌握学习Folin-酚测定蛋白质含量的原理及方法，制备标准曲线测定未知样品中蛋白质含量。同样利用与标准曲线对照来得到试样的蛋白质含量，并测出酶的比活力。测量蛋白质的方法有多种，我们必须根据所做实验的具体选择合适的方法来测定蛋白质。第五次的实验是微量凯氏定氮测总蛋白。目的是要求同学掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理及方法。本实验除利用了凯氏定氮法外还加上了酸式滴定法最后得出了毫克级别的总蛋白含量。其结果与上一实验所测得的总蛋白质含量有所不同，正证明了不同的方法测量蛋白质造成的误差不同，致所得结果不同。最后一次实验为SDS-PAGE测定蛋白质分子质量，目的为掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和测定蛋白质分子量技术。此实验操作复杂，需先制作凝胶再结果染色脱色，最后还要制作标准蛋白分子质量曲线图来进行试样对照。最后得到蔗糖酶的分子量在5万左右及9万左右。关键字：实验；提取液；比活；蛋白质；SDS-PAGE；OD正文：1， 蔗糖酶的提取及提纯1.1， 文献综述：蔗糖酶的分离利用的是细胞破壁法。细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材料不同，破壁也方法不同。我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞破坏，是细胞内物质释放出来。自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。 自溶法的缺点是时间较长。 本实验的自溶条件是：加乙酸钠保持弱碱性条件、35 、加入乙酸乙脂代替防腐剂，0.5-1h。自溶法的操作较简单方便，适合学生操作。1.2， 材料与方法1.2.1，材料：啤酒酵母；醋酸钠；甲苯；4mol/L醋酸；95%乙醇；0.5mol/Lris-HCl PH7.3缓冲液；锥形瓶；量筒；烧杯；具塞试管；吸球；培养箱；恒温水浴锅；磁力搅拌器；搅拌子；高速冷冻离心机；1.2.2，方法：1.2.2.1,酵母自溶：n 250毫升锥形瓶 ,加入20克鲜酵母n 加入醋酸钠1.6克，搅拌使团块的酵母液化n 加1.5毫升甲苯，包扎好瓶口，摇动10分钟，使充分混匀n 放入37培养箱，保温48-60小时，使酵母自溶1.2.2.2,初提液A制备.n 在培养箱中取出装有已自溶酵母的三角瓶，加10毫升蒸馏水，摇匀，倒入离心管1中，平衡（互加平衡）。n 用高速冷冻离心机4，15000rmin离心10min。n 离心管中的悬浮液分三层，上层为浆状物（甲苯及其抽提物)，下层为固体（细胞碎片沉淀），中间一层为液体(含酶)。n 小心仔细地取出中间层的液体，重新倒入离心管2中，4，15000rmin离心10min （互加平衡）。n 取上清液倒入n 25毫升量筒 n 量体积记录VAn 取出3ml保存n 得初提液A1.2.2.3,热提取液B制备:n 将初提液A（VA-3ml）倒入50毫升的三角瓶中，加4mol/L的醋酸3.2ml左右，使溶液的pH值约为4.5左右，摇匀n 50恒温水浴中保温25min(注意温度绝对不能超过50)，在保温过程中不断的摇动三角瓶n 离心：4，15000rpm，10min n （H2O平衡）n 仔细地倒出上层清液入10ml量筒测量体积，记为VB，此提取液为热提取液B。n 取出3ml于具塞试管保存，用于后续实验。1.2.2.4,乙醇沉淀提取液C制备n 将热提取液B （VB-3ml）倒入100ml的烧杯中，放入加有碎冰的大烧杯冰浴，置于磁力搅拌器上，缓慢加入体积（VB-3ml ）-20 95%乙醇。整个过程不少于25min，结束后再继续搅拌5minn 将烧杯内的液体全部移入离心管中，杯底白色固体保留待用，4，15000rpm,离心10min 加（ 95%2）乙醇平衡。离心后弃去上清液 n 用5毫升tris HCL溶解烧杯中的白色固体，再倒入离心管中搅拌使管内的固体溶解，再次离心， 4，15000rpm,10min,平衡用tris HCL溶液平衡 n 离心后取上层清液入10ml量筒n 测量体积，记为VCn 此提取液为乙醇沉淀提取液Cn 测量其体积为VC。全部保存于具塞试管，用于后续实验。1.3,结果与讨论实验得到ABC各三种不同程度纯化的蔗糖酶提取液，颜色各从深及浅，说明蔗糖酶本身的颜色较浅。初提液A热提取液B乙醇沉淀提取液C溶液体系水溶液醋酸tris HCl特点pH值4.5左右pH值7.3左右体积/ml1619.047.9颜色状态黄色溶液黄色溶液淡黄色溶液影响因素温度、酸碱度控制不准会影响蔗糖酶产量1.4,结论实验中在将提取液A水浴时必须不断摇动锥形瓶，温度不能超过50，取出后迅速在水浴中冷却，之后所有的操作都必须在冰浴上。而在提取液B放入乙醇时，必须要保证乙醇的速度缓慢，是乙醇混合均匀，析出最大量的沉淀使所需酶充分变性沉淀。整个操作必须严谨细心，保证蔗糖酶得到了最优纯化。提纯酶时可以充分利用蛋白质的变性、复兴的性质来得到纯化的酶液。2,蔗糖酶的纯化Q Sepharose -柱层析法 2.1文献综述：通过对不同离子交换层析方法的比较 ,进行酵母蔗糖酶纯化实验改进 ,采用 Q Sepharose离子交换介质 ;流动相经 5 0 min由 0 .0 5 MTris- HCLp H7.3缓冲液到 1MNa CL的 0 .0 5 MTris- HCL p H7.3缓冲液 ,进行梯度洗脱分离 ,分离效果最好 ,蔗糖酶与杂蛋白得到了有效的分离 ,回收率为 93.2 %,是现有实验的 3.17倍 ,浓缩倍数为 2 .91,是现有实验的 1.4 3倍 ,提高了实验效果。2.2,材料与方法2.2.1,材料n 试剂：0.05mol/LTris-HCl PH7.3缓冲液；1mol/LNaCl和0.05mol/LTris-HCl PH7.3缓冲液; 0.5mol/LnaOH; Q Sepharosen 器具：层析柱、梯度发生器及搅拌子、紫外分光光度计、点滴板等2.2,.2, 方法2.2.2.1,离子交换柱的填充n 固定和清洗：层析冲洗。下面留一点水。柱子垂直固定，下端的橡皮管夹子夹紧、取下上部盖子，加水5毫升n 凝胶装柱：高约5公分，上面填平，注意上部水面高于交换剂平面，放松夹子，使水流下，直到与表面相切，夹紧夹子。2.2.2.2,缓冲液盐度梯度发生器的安装n 连通：先加入水，两个旋钮朝一个方向可以连通，使液体进入，连接桥不可以有气泡。然后使旋钮回到正中，加入相应的溶液。n 装入溶液：第一个杯子加入20毫升 0.05摩尔/升 Tris HCl pH 7.3 ，并加入磁力棒 ，第二个加入 20毫升 1摩尔/升 NaCl2.2.2.3,柱的平衡n 在小烧杯中加入15毫升Tris HCln 恒流泵进口插入烧杯液面下n 恒流泵出水管一端连接柱子n 放松夹子n 打开恒流泵n 用Tris HCl冲洗n 直到缓冲液面与交换剂相切2.2.2.4,加样及洗穿透峰：n 夹紧下端夹子, 在烧杯加入15毫升Tris HCln 从上部缓慢加入0.5ml提取液C，放松夹子n 样品全部刚好进入交换剂内，相切，夹紧夹子n 先打开恒流泵，再放开夹子n 用量筒收集全部流出液体，每管收集3mln 直到液面相切2.2.2.5,氯离子梯度洗脱n 将梯度发生器出口与恒流泵相连n 恒流泵与柱相连n 打开搅拌器，打开连通器旋钮，打开恒流泵 n 用20 毫升Tris HCl 缓冲液配制的n 1摩尔/升 NaCl20 毫升溶液n 开始梯度洗脱 n 打开夹子n 用量筒收集3 毫升/管，n 直到全部缓冲液流出2.2.2.6, 离子交换剂的再生n 烧杯加入15 毫升 NaCl洗脱 不用收集 凝胶冲到小烧杯 全部凝胶回收n 最后一个班用0. 5摩尔/升 NaOH洗3CV，除去氯离子，不用回收洗脱液最后凝胶回收，冲到烧杯里面2.2.2.7, 用紫外分光光度计测每管的紫外吸光度OD值，并记录。测定后样品回收!2.2.2.8, 酶活力测试n 样品选取（老师指导下）n 从洗穿透峰样品中选择1-2个蛋白质浓度较高的样品测定酶活力n 从梯度洗脱样品中选取峰值附近的几个样品进行酶活力测定。n 酶活力测定：点滴板中滴2滴5%蔗糖加2滴待测洗脱液玻璃棒搅匀放置5min浸入葡萄糖试纸1s（延长时间）取出过 60s比较颜色深浅用“+”表示酶活力的大小 n 体积测定n 将酶活力较高的2-3个样品合并测量体积（洗穿透峰样品不用合并），记为VD，用具塞试管保留，其他样品可以洗掉。2.3,结果与讨论2.3.1结果 酶活力测试：0.081 0.171 0.144 0.111 0.034 0.018 0.077 0.009 0.048 0.0500.139 0.181 0.220 0.283 0.525 0.6330.584 0.375 0.224 0.1540.206 0.309 0.291 0.180 0.06 0.025保存11，13管 V=5.3mlOD值分布图2.3.2分析 此图有3个峰。第一个峰用无盐的Tris-HCIpH7.3缓冲液， 所以洗脱出来的是缓冲液无蔗糖酶。第二个峰是线性洗 脱，采用CI-带动蛋白质往下降，随着CI-浓度增加，蔗 糖酶的浓度有一个最大值。第三个峰是应为酶提取液C中3， 蔗糖酶活力的测定a) 3.1，文献综述: 在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系，可用于比色测定，可用DNS比色法测定还原糖的含量，可用DNS比色定糖法测定蔗糖 酶的活力.。3.2，材料与方法3.2.1，材料n 试剂3、5-二硝基水杨酸；葡萄糖标准溶液0.2mg/ml； 0.2mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.6； 5%蔗糖 用0.2mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.6配置；2mol/L NaOH n 器材：电炉；恒温水浴锅；分光光度计；试管、移液管3.2.2，方法3.2.2.1，葡萄糖标准曲线制作n 烧水，不要太多n DNS反应：注意振荡混匀，移液管对应，要及时清洗试管号012345葡萄糖/ml00.60.81.01.21.4蒸馏水/ml3.02.42.22.01.81.6DNS/ml1.51.51.51.51.51.5总体积/ml4.54.54.54.54.54.5n 测吸光值n 于540波长处测OD值。用0号做对照。n 测定要求：测定数据在（0.1-0.7A），波动可以到0.2-0.8，最小不能小于0.1，最大不能超 过1.0。n 绘制葡萄糖标准曲线：以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出葡萄糖标准曲线。数据结果回去处理。n 要求R2值接近1，至少0.999。3.2.2.2, 酶活力测定n 稀释样品：n 稀释方法：提取液ABCD比例1：2001：2001：2001：20移液管原液0.25ml0.25ml0.25ml0.5ml定容50ml容量瓶50ml容量瓶50ml容量瓶10ml移液管n 稀释顺序：浓度从低到高，即CBA，防止污染。n 水解反应 试管项目 A0A1B0B1C0C1D0D1酶液A稀释液各取4种稀释液2.00 ml，加入8支试管，按项目名称编号NaOH ml变性 0.5-0.5-0.5-0.5-预热5%蔗糖试剂瓶，8支试管（放在试管架上），于35 预热10min蔗糖ml各试管加入5%蔗糖 2 ml加入后立即摇匀开始计时，35准确反应3minNaOH 终止反应-0.5-0.5-0.5-0.5总体积/ml 4.504.504.504.504.504.504.504.503.2.2.3, 进行DNS反应，测吸光值试管号/mlA0A1B0B1C0C1D0D1反应液V测0.10.10.10.10.150.150.30.3从上次水解反应液中分别取出V测，用ABCD移液管，先取对照 蒸馏水2.92.92.92.92.852.852.72.7DNS1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 总体积4.54.54.54.54.54.54.54.5n 测吸光值n 调零：以A0、BO、C0、D0分别作对照调平。每组需重新调平。n 测过的样品不要倒掉。n 如果测得的OD 值结果不在标准曲线还原糖范围内，则可增加或减少取样量，加倍或减半，重新做DNS反应，直到OD值在标准曲线范围内为止（0.1-1.0之间）。n 吸光值结果分别代入葡萄糖曲线公式，计算4.5 ml溶液中所含还原糖的量（以葡萄糖计），用表格记下。3.2.2.4, 计算出酶活力单位3.3,结果与讨论 1.结果 A0AB0BC0CD0DV0.150.150.250.250.100.100.300.30蒸馏水2.852.852.752.752.902.902.702.70DNS1.51.51.51.51.51.51.51.5V测00.9380100.72100.632OD值00.47000.51200.34000.287mg04.5004.9003.5803.17vA总=16.0 vB总=15.5 vC总=7.9 Vd =56.7 项目 初提取液A 热提取液B乙醇提取液C 柱分离液D总活力单位数/U36700363821832213271回收率/%1009949.936.2 2.讨论 随着蔗糖酶的提纯，纯化柱分离与蔗糖酶的总活力单 位数依次下降，这是由于随着每一步进行，难免有损 失，或者有舍弃部分，因此酶的总活力单位数依次下 降；由酶的回收率的定义可知，在该实验中随着每一 步纯化步骤的进行，由于操作上的损失以及纯化过程 中的取舍原因，每一次的分离纯化得到的蔗糖酶的总 活力单位数依次下降，因此酶的回收率也依次下降。4， 蔗糖酶蛋白质含量测定a) 4.1，文献综述: 凡含有两个及两个以上肽键（CONH）的化合物（如双缩脲：H2NCONHCONH2），在碱性溶液中（如Folin-甲试剂）都能与Cu2+作用，形成紫色的复合物；蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接起来的，故所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应，形成紫色的铜-蛋白质复合物；铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸（Folin-乙试剂）还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅（在一定范围内）与蛋白质的含量成正比； 在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中（双缩脲法、 Folin-酚法和紫外吸收法），Folin-酚法的灵敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比双缩脲法高100倍），所以我们选用本方法。4.2，材料与方法4.2.1材料n 试剂：试剂A：碱性铜试剂（碱性）；试剂B：酚试剂，黄色试剂，保存在棕色瓶中；标准浓度牛血清白蛋白溶液（200ug/ml）；Na2WO42H2O；Na2MoO42H2O；85%H3PO4；浓HCl；Li2SO4H2O；溴水；酚酞指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO45H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。n 器具：721分光光度计刻度吸管0.5ml（*1），2ml*2， 5ml*1试管1.5cm*15cm（ *8）恒温水浴槽4.2.2，方法4.2.2.1蛋白质含量标准曲线绘制n Folin-酚反应所加试剂/ml管号012345标准牛血清蛋白液/ml00.20.40.60.81.0水 / ml4.54.34.13.93.73.5试剂A / ml1.01.01.01.01.01.0摇匀，静置10min 试剂B / ml第一次0.30.30.30.30.30.3立即迅速充分混合，加一管摇一管，静置10分钟 第二次0.20.20.20.20.20.2立即迅速充分混合，加一管摇一管，55 5min，注意水浴锅水位足够，取出试管置于冷水冷却1Min 总体积/ml6.06.06.06.06.06.0OD660n 测吸光值：OD 660nm；0号试管作对照n 绘制标准曲线：横坐标为标准蛋白质微克数，纵坐标为吸光值。n 未知蛋白质浓度测定 样品稀释ABCD稀释比例1:100 1:1001:201:1稀释方法0.5ml原液：50 ml容量瓶0.5ml原液：50 ml容量瓶0.5ml原液 +9.5 ml 移液管量取不稀释测样品蛋白含量试剂量/ml所加试剂管号A0A1B1C0C1D0D1样品稀释液/ml移液管：酶液00.50.51/20 Tris 0.5 ml0.5Tris 3ml3水 / ml4.54.04.04.04.01.51.5试剂A1.01.01.01.01.01.01.0试剂B第一次0.30.30.30.30.30.30.3第二次0.20.20.20.20.20.20.2总体积/ml6.06.06.06.06.06.06.0OD660nm/A4.3，结果与讨论各样品测定结果表 管号项目A1B1C1D1OD660nm/A0.4140.2240.4060.155蛋白含量/ mg0.1160.0580.1060.038总蛋白/ mg139.296.0030.240.0760比活力（U / mg）37.826.067.23498.7各提取液酶活力等比较总体积/ml总酶活/U总蛋白/mg比活力/U/mg蛋白回收率%酶活回收率%纯化倍数/倍初提液A6.05265139.237.81001001热提取液B6.02494.896.026.069.047.40.69乙醇提取液C6.02031.830.2367.221.738.61.78柱分离液D6.0265.90.4563498.70.335.192.564.4结论本次实验利用了Folin-酚原理，该实验方法灵敏度高，但蛋白质浓度和光密度的线性关系不够严格，而且不同的蛋白质的Tyr和Typ含量不同，显色程度也会有差异，所以造成了实验的一些误差，使制作的曲线线性程度不够，且B的纯化倍数1.另实验中的一些操作不规范，也可能导致实验结果产生误差，故在实验中必须规范实验操做，仔细滴加试剂，减小实验误差。5， 微量凯氏定氮法测总蛋白氮5.1，文献综述: 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。 蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。(参考文献：微量凯氏定氮法测定食品中粗蛋白的含量)5.2，材料与方法5.2.1，材料n 试剂：（1）蛋白样品：2g牛血清蛋白溶于0.9% NaCl溶液并稀释至100（2）98% 浓硫酸 。（3）硫酸钾3份与硫酸铜1份（w/w）混合研磨成粉末。（4）30%NaOH溶液：30 g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100 ml。（5）2%硼酸溶液：2 g溶于蒸馏水，稀释至100 ml。（6）混合指示剂：0.1 %甲基红乙醇溶液与0.1 %甲基蓝乙醇溶液，临用时按2:1的比例混合。或0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液,临用时按1:5的比例混合。（7）0.01mol/L HCl标准溶液n 仪器：改良式凯氏定氮仪5.2.2，方法5.2.2.1，消化原理：NH2CH2COOH + H2SO4 2CO2 + 3SO2 + H2O + NH3 （1） 2NH3 + H2 SO4 （NH4）2 SO4 （2）5.2.2.2，洗涤 n 蒸汽发生器2内通入水，2/3左右 n 漏斗3加入10ml 蒸馏水，流入反应室1，中间用夹子夹住 n 100ml锥形瓶盛有2%硼酸液10.0ml和指示剂4滴，冷凝管的管口插入酸液内0.5cm，硼酸液颜色不变色（变淡可以），表示仪器洗净。变色需吸去重新洗。 n 加热，产生蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝的液体流入接收瓶9 n 移去硼酸，继续蒸馏1min ，用水冲洗冷凝管口，吸去反应室残液。n 吸去反应室残液方法：除去锥形瓶，撤去酒精灯，蒸汽瓶温度降低，压力减小，导致反应室内高压气体将反应室内液体压入蒸汽瓶，反应室内残液即被倒吸出去。然后放开上下端水管，使液体流出一会儿，冷却反应室和蒸汽瓶。5.2.2.3，蒸馏 n 蒸汽发生器2内通入水，2/3左右 n 由小漏斗加入5 ml消化液V3至反应室，用蒸馏水洗涤小漏斗，洗涤液由小漏斗流入反应室，高度低于球部n 用小量筒量取10ml 30% NaOH ，倒入小漏斗，放松弹簧夹，流入反应室，当小漏斗内仍有少量NaOH 溶液时，夹紧夹子。n 再加约3 ml 蒸馏水于小漏斗内，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。n 100ml锥形瓶盛有2%硼酸液10.0ml和指示剂4滴，管口插入酸液内0.5cmn 接受瓶先放置好再开始加热，产生蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝的液体流入接收瓶9 n 当硼酸液由葡萄紫色变成绿色后再蒸馏3 Min 然后降低锥形瓶，使冷凝管口离开酸液液面约1 cm 。再蒸馏1min 用少量蒸馏水冲洗冷凝管口，移去锥形瓶，准备滴定。吸去反应室残液，洗涤反应器。n 重复蒸馏三次，每次均需洗涤，方法同步骤（二）5.2.2.4，滴定n 用0.01 mol/L HCl 溶液滴定锥形瓶中的硼酸液至粉红色即可，记录所耗的HCl 溶液量。n 原理： （NH4）2B4 O7 + 2 HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO3 （5）n 注意：滴定管要排除里面气体。5.3,结果与讨论1.结果 滴定所消耗的0.01mol/LHCI溶液体积为 V1=0.43ml V2=0.44ml V3=0.44ml V11=0.40ml V22=0.44ml V33=0.40ml V平均=0.425ml样品B含氮量=0.425*0.01*14.008*50/0.05*5=11.91mg/ml 蛋白质含量=11.91*6025*20.67=1538.6mg 2.分析 与上一次Folin-酚法测定的结果有差异，可能原因有： 样品B中含有-NH2基因等杂质，消化时产生的NH3比实际蔗糖酶等消化产生的NH3高，导致结果偏高。由于凯氏定氮法测得的样品中含氮的总含量，因此样品中混有其他无机氮化合物被算入总氮量，使结果偏高。 由于操作不当引起误差。 6,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量 6.1,文献综述：各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小和形状不同而有不同的迁移率。消除净电荷对迁移率的影响，可采用聚丙烯酰胺浓度梯度电泳，利用它所形成孔径不 同引起的分子筛效应，可将蛋白质分开。也可在整个电泳体系加入十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl slfate简称SDS），则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带的净电荷和形状无关，这种电泳方法称为SDS-PAGE。 用SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理：SDS是阴离去污剂，在单体浓度为0.5mmol/L以上时，蛋白质和SDS就能结合成复合物；当SDS单体浓度大于1mmol/L时，它与大多数蛋白质平均结合比为1.4g SDS/1g蛋白质；在低于0.5mmol/L浓度时，其结合比一般为0.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了 不同种类蛋白质间原有电荷的差异，均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽组分分成单个亚单位。SDS可使蛋白质的氢键、疏水键打断，因此它与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。此复合物的流体力学和光 学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似雪茄形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同，约1.8nm，而长轴改变则与蛋白质的分子量成正比。基于上述2种情况，蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是与椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子 量的函数有关。进行SDS-PAGE时，可利用已知分子量蛋白质的电泳迁移率和分子量的对数作出 标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。用此法测定蛋白质分子量具有仪器设备简单，操作方便，样品用量少，耗时少（仅需一天），分辨率高，重 复效果好等优点，因而得到非常广泛的应用与发展。它不仅用于蛋白质分子量测定，还可用于蛋白质混合组分的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS-PAGE分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。（参考文献：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理）6.2，材料与方法6.2.1，材料n 30%丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺（Acr作为单体） 29.2g，甲叉双丙烯酰胺 (Bis作为交联剂）0.8g，溶解于双蒸水100ml，中枢神经毒物凝聚后无毒。n 10%的N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)：0.1mlTEMED+0.9ml双蒸水（凝固加速剂）；n 10过硫酸铵溶液（凝固的催化剂）； n 分离胶缓冲液贮液（1.5molL Tris-HCl，pH8.8）；n 浓缩胶缓冲液贮液（1molL Tris-HCl，PH6.8）；n 2SDS-样品缓冲液：1ml浓缩胶缓冲液贮液 + 4ml 10%SDS + 1ml疏基乙醇 + 2ml甘油 + 0.5ml 0.1%（w/v）溴酚蓝（电泳指示剂），加双蒸水至10ml。4保存；n SDS-电极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1SDS，pH8.3）：在900ml双蒸水中溶解15.1g Tris和94g甘氨酸，加入50ml 10%（w/v）SDS贮液，加双蒸水补至1000ml则成5SDS-电极缓冲液；n 10% SDS：25g SDS用双蒸水溶解至250ml，室温保存； n 染色液：0.25gR250考马斯亮蓝溶于90ml甲醇水（11，v/v）和10ml冰乙酸的混合液n 脱色液：50ml甲醇加75ml冰乙酸，加蒸馏水至1000ml；n 蛋白质样品液：A、B、C、D；n 标准蛋白质：包括兔磷酸化酶B，MW97400；牛血清蛋白，MW66200；兔肌动蛋白， MW43000；牛碳酸酐酶，MrW31000；胰蛋白酶抑制剂，MW20100；鸡蛋清溶菌酶，MW14400。6.2.2，方法6.2.2.1，玻璃板清洗和安装6.2.2.2，分离胶制备n 配分离胶成分：12%分离胶分离胶缓冲液30%聚丙烯酰胺贮液10% SDS10% 的过硫酸铵溶液水10%的TEMED2.5ml4.0 ml0.1 ml0.1ml3.3 ml55 ul移液管Acr移液管用后要洗移液枪AP,移液枪移液管