生物化学实验讲义-正式-1.doc

生物化学实验讲义化学与环境工程学院化学与环境实验教学中心2011-09-01 目 录生物化学实验室规则3实验一 氨基酸的分离鉴定纸层析法4实验二、乳中酪蛋白的分离6实验三 蛋白质等电点测定和沉淀反应7实验四 蛋白质的定量测定11实验五 植物叶片中过氧化脂质含量的变化13实验六 植物过氧化酶活性的测定14生物化学实验室规则1 每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。2 实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。3 实验过程中要听从教员的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教员检查签字同意，方可离开实验实。4实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。5使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教员，不得擅自动手检修。6 实验室内严禁吸烟！注意水电安全，离开实验室前，必须关好水龙头，拉下电闸，严防发生事故！7 废液倒入专门的废液桶，固体废物和带残渣的废物不得倒入水槽或到处乱扔。8 仪器损坏时，应如实向教员报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。9 实验室内一切物品，未经本室负责教员批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。10每次实验课由班长负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的安全、卫生和一切服务性的工作。实验一 氨基酸的分离鉴定纸层析法 一、实验目的 1. 学习纸层析法的基本原理和操作技术 2. 掌握氨基酸Rf值的计算方法3. 掌握通过已知氨基酸对未知氨基酸和未知混合氨基酸组分进行鉴定 二、实验原理 层析法又称色层分析法，根据支持物的不同分为吸附层析、离子交换层析、分配层析。纸层析是常用的、经典的分配层析技术，支持物是滤纸，固定相是水，流动相为有机溶剂。将样品点在滤纸上（这点称为原点），用扩展剂进行展层时，样品中各种的溶质即在两相溶剂中不断的进行分配，由于个溶质在两相溶剂中的分配系数a（a=溶质在流动相中的溶解度/溶质在固定相中的溶解度）不同，因而不同溶质随流动相移动的速率不等，从而将其分离开来行程距离不等的层析点。溶质在滤纸上的位置可用比移值（Rf）表示： Rf=原点到层析点中心的距离/原点到扩展剂前沿的距离对同一溶质来说，层析条件不变Rf是一常数，所以可以利用溶质的Rf值做出定性分析。根据Rf值可以用已知氨基酸鉴别未知氨基酸和混合氨基酸的组分。三、实验材料、试剂和仪器 1. 材料、试剂 （1） 扩展剂将20ml正丁醇和5ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15ml水混合，充分震荡，静置后分层，放出下层水层。将漏斗内的扩展液放入磨口瓶中备用。（2） 氨基酸溶液：0.5%赖氨酸；0.5%脯氨酸；0.5%缬氨酸；赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸混合溶液各组分的浓度均为0.5%。（3） 显色剂：0.1%水和印三酮正丁醇溶液（0.1g印三酮溶于100ml水饱和正丁醇溶液）2. 仪器：培养皿；滤纸；表面皿；毛细管；喷雾器 四、操作步骤 1. 取直径12.5cm圆形滤纸一张，用铅笔过圆心作两条相互垂直的线，在每条线上距圆心0.5cm处做标记（画一个点）并分别在其边缘上标上赖、脯、缬、混等字样。2. 用毛细管分别蘸取测定液各一滴，在滤纸的样应点样。等一次点样干了之后再点一次，重复23次，点样直径不超过3mm。3. 用小枪头或其它在滤纸圆心扎一小孔，另取滤纸将其卷成筒状，捻紧如灯芯，底部用剪刀剪成碎条状，从滤纸的点样背面插入小孔，突出滤纸面约0.5cm。4. 在表面皿中加入约3ml扩展液，再将其放入培养皿正中，将滤纸平放在培养皿上，使滤纸芯浸入到扩展液中，盖上培养皿，待扩展剂距边缘1cm时，即可取出停止层析。用铅笔画出扩展液前沿后，吹干或烘干。5. 将滤纸平放在表面皿上，喷雾0.1%水和印三酮正丁醇溶液再吹干或烘干，观察层析出现的弧形紫色斑。用铅笔标出原点到层析点中心的距离和到扩展液前沿的距离，计算Rf值。 实验二、乳中酪蛋白的分离一、实验目的 掌握从乳中制备酪蛋白的原理和方法 二、实验原理 酪蛋白是乳中存在的主要蛋白质，含量约为35g/l，酪蛋白不是一种简单的蛋白质，而是一些含磷蛋白质的混合物。在某一pH值下，氨基酸分子所带正负电荷相等，本身呈电中性。这时溶液的pH值称为氨基酸的等电点。氨基酸在其等电点时溶解度最小，易发生沉淀。利用这一性质将牛乳pH值调到4.8，酪蛋白即可沉淀出来，酪蛋白也不溶于乙醇，利用这一性质可以从酪蛋白粗制品中去掉不需要的脂类物质。三、实验材料、试剂和仪器 1.材料、仪器 牛乳；100温度计；细布或纱布；布氏漏斗和滤纸；烧杯；量筒；玻璃漏斗；电炉；抽滤瓶；pH试纸。 2.试剂 0.2N，pH4.6醋酸钠缓冲液（27.22g/L NaAc.3H2O）；95%乙醇；乙醚；乙醚：乙醇=1：1 四、操作步骤 1.把100ml牛乳放入一个500ml烧杯中，并加热至40在搅拌下慢慢加入100ml 40的醋酸钠缓冲液。 2.混合液的最终pH应为4.8，可用pH计校正。 3.将上面悬浮液冷却至室温，然后放置5min，用细布或纱布过滤。 4.所得沉淀用少量水洗几次，然后悬浮于大约30ml乙醇中。 5.将上述悬浮液倾入布氏漏斗中过滤，然后用等体积的乙醇和乙醚混合液洗两次。 6.最后，用50ml乙醚洗沉淀并抽干。 7.将沉淀从布氏漏斗中移去，摊开在表面皿上待乙醚挥发即得酪蛋白纯品。 五、计算算出每百毫升牛乳中酪蛋白的含量（%）。若以3.5%为理论产量，算出回收率（%）。附：醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2M)PH180.2MNaAc毫升0.2MHAc毫升PH180.2MNaAc毫升0.2MNaAc毫升3.60.759.254.85.904.103.81.208.805.07.003.004.01.808.205.27.902.104.22.657.355.48.601.404.43.706.305.69.100.904.64.905.105.89.400.600.2N醋酸钠溶液 = 27.22g/L NaAc.3H2O实验三 蛋白质等电点测定和沉淀反应一、蛋白质的等电点测定 1. 实验目的 （1）了解蛋白质的两性解离性质。 （2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。 2. 实验原理 蛋白质是两性电解质。蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液酸碱度的影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上的正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动也不向阳极移动。此时溶液的pH称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测定其溶解度最低时的溶液的pH值。 本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 3. 实验材料、试剂和仪器 （1）材料、仪器恒温水浴锅；200ml锥形瓶；100ml容量瓶；移液管；试管；试管架；乳钵（2）试剂 0.4%酪蛋白醋酸溶液：取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细研磨，将所得的蛋白质悬浮液移入200ml锥形瓶中，用少量4050温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10ml 1mol/l醋酸溶液。把锥形瓶放入50水浴中，并小心的地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内溶液全部移至100ml容量瓶内，加水至刻度，塞紧瓶塞，混匀。 1.0mol/l醋酸溶液 0.1mol/l醋酸溶液 0.01mol/l醋酸溶液 4.操作步骤 （1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。试管号 蒸馏水（ml） 0.01mol/l醋酸0.1mol/l醋酸 1.0mol/l醋酸1 8.4 0.6 0 0 2 8.7 0 0.3 0 3 8.0 0 1.0 0 4 7.4 0 0 1.6 (2)向以上试管中加入酪蛋白的醋酸钠溶液1ml，加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5，观察其浑浊度。静置10min后，再观察其浑浊度。最浑浊的一管的pH值即为酪蛋白的等电点。 二、蛋白质的沉淀和变形 1.实验目的 （1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 （2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 （3）了解蛋白质变性和沉淀的关系 2.实验原理在水溶液中蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。 蛋白质的沉淀反应可分成两类。 （1）可逆的沉淀反应：此时蛋白质的分子结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 （2）不可逆的沉淀反应：此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质变性而沉淀，不在溶于原来的溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液的稳定性的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都变性。 3.试剂与材料 （1）蛋白质溶液：5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9） （2）pH4.7醋酸醋酸钠的缓冲溶液 （3）3%硝酸银溶液 （4）5%三氯乙酸溶液 （5）95%乙醇 （6）饱和硫酸铵溶液 （7）硫酸铵结晶粉末 （8）0.1mol/l HCl溶液 （9）0.1 mol/l氢氧化钠溶液 （10）0.1 mol/l醋酸溶液 （11）甲基红溶液 （12）2%氯化钡溶液 4.操作方法 （1）蛋白质的盐析 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。 如球蛋白可在半饱和硫酸铵中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析是可逆的。 加5%卵清蛋白溶液5ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混合后静置数分钟则析出球蛋白沉淀。倒出少量浑浊溶液，加少量水，是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向管中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水。观察沉淀再溶解。 （2）重金属离子沉淀蛋白质 重金属离子与蛋白质合成不溶于水的复合物。 取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加3%的硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，有沉淀产生放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，沉淀是否溶解？为什么? (3) 某些有机酸沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白质2毫升，再加入1毫升三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀加入少量水。观察沉淀是否溶解？ （4） 有机溶剂沉淀蛋白质 取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加入2毫升95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。 （5） 乙醇引起的变性与沉淀 取三支试管，编号。以下表顺序加入试剂： 试剂（毫升）管号5%卵清蛋白溶液0.1mol/l氢氧化钠溶液0.1mol/l盐酸溶液95%乙醇pH4.7的缓冲溶液110011211010310110振荡摇匀后，观察各管有何变化。放置片刻。向各管中加入8毫升水，然后在2、3管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol/l醋酸溶液及0.1mol/l碳酸钠溶液中和之，观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/l盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。实验四 蛋白质的定量测定 一、实验目的 学习双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法 二、实验原理 含两个或两个以上肽键的化合物如蛋白质与碱性硫酸铜反应产生一种紫红色的化合物。颜色的深浅与蛋白质中所含的肽键的数目有关。反应的名称就是从双缩脲这一物质的名称来的。它产生典型的正反应。有色复合物可能是铜离子和四个氮原子共同络合而成的。其中四个氮原子是由两条肽链中的每一个各提供两个氮原子构成的。 双缩脲反应对任何蛋白质的测定都是适合的。其缺点是蛋白质样品的需要量大。此外，双缩脲反应对肽键不是完全专一的，因而含有一个氮原子或含有一个碳原子相连接的两个羟基的任何化合物都有双缩脲反应。这样，用双缩脲法测定蛋白质的含量尽管方便、快速但灵敏度较低。 三、实验材料、试剂和仪器 1. 材料、仪器 试管、试管架、吸量管、分光光度计 2. 试剂 （1）标准酪蛋白溶液（5mg/ml）：用0.05M氢氧化钠配制成5mg/ml的标准酪蛋白溶液。（2）双缩脲试剂：溶解1.5g硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H4O64H2O）溶于500ml水中，在搅拌下加入300ml 10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1000ml，贮存在内壁涂以石腊的瓶中。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。（3）卵清蛋白 四、实验操作步骤 （一）酪蛋白标准曲线的制备试管号123456标准酪蛋白液（ml）00.40.81.21.62.0水（ml）21.61.20.80.40双缩脲试剂（ml）444444在室温下静置30分钟546nmOD值测每管的吸光值（OD），以OD为纵坐标，酪蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 （二）未知样品中蛋白质浓度的测定 1.取卵清蛋白8克，用蒸馏水定容到100毫升。 2.取2支试管分别加入1毫升稀释蛋白，加1毫升蒸馏水和4毫升双缩脲试剂，混合均匀，室温放置30分钟，测定OD546值。 3.从标准曲线找出对应的蛋白质含量。 4.计算卵清蛋白的百分含量。 五、注意事项1.本实验方法测定范围为1-10mg/ml蛋白质，必须于显色后30min内比色测定。2.有大量脂肪存在时可产生浑浊，应用石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。3.为节省时间，样品处理时可与标准品同步进行。六、思考题1.干扰本实验的因素有哪些？2.对于作为标准的蛋白质应有何要求？实验五 植物叶片中过氧化脂质含量的变化见生物化学实验（董晓燕）P60-61。实验六 植物过氧化酶活性的测定一、实验目的 1、 掌握过氧化物酶（POD）活性的测定二、实验原理当植物衰老特别是处于逆境的条件下