蛋白质的离子交换层析技术.doc

离子交换层析技术层析（chromatography）也称为色谱，就是将混合物中各种组分分离的方法，是分离、纯化及鉴定生物大分子时最常使用的技术之一。一个层析系统都包括两相，即固定相和移动相。当移动相流过加有样品的定相时，由于各组分在两相之间的分配比例不同，它们（各组分）就会以不同的速度移动而相互分离开来。定相可以是固体，也可以是被固体或凝胶所支持的液体。定相可以被装入柱中或涂成薄层、薄膜，成为层析“床”。动相可以是气体，也可以是液体，前者称为气相层析，或者成为液相层析。离子交换层析技术是以离子交换纤维素、离子交换树脂或离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以待分离的样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。（一）原理 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素OC6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素OCH2COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为球蛋白，球蛋白和球蛋白。 在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。 交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。 （二）常用离子交换剂的种类与特性 1.离子交换纤维素 离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表11所示。表1-1 离子交换剂的类型与特点交换剂名 称（纤维素）作 用 基 团特 点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H氨乙基AE+-O-C2 H4-N H2胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂羧甲基CM-O-CH2-COO最常用在pH4以上磷酸P-O- P O2用于低pH磺甲基SM-O-CH2-SO3磺乙基SE-O-C2H4-SO3强酸性用于极低pH在交换纤维素中，最常用的是DEAE纤维素和CM纤维素。由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异。一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表12）。表1-2 商品DEAE纤维素和C M纤维素的类型和特性纤维素形状长度交换当量（毫克当量/克）蛋白质吸附容量（mg /g牛血清白蛋白）床体积（ml / g）pH 6.0pH 7.6DE-22改良纤维124001.00.14507.77.7DE-23改良纤维（除细粒）184004508.39.1DE-32微粒型（干）24636606.06.7DE-52微粒型（湿）24636606.06.3DE-11旧型号50250130与以上相应型号同溶菌酶pH5CM-220.60.066007.77.7CM-236009.19.1CM-321 2606.86.7CM-521.00.11 2606.86.7离子交换纤维素的优点为：离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量最大；离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广。2离子交换交联葡聚糖 离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子交换纤维素不同点是载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表1-3。表1-3 常用交联葡聚糖的类型与特性类 型性 能离子基因反离子总交换容量（毫克当量/g）DEAE-sephadexA-25弱碱性、阴离子交换剂DEAE+Cl3.50.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱碱性、阴离子交换剂QAE+季胺基团(-N(CH3)3)Cl3.00.4QAE-sephadex A-50CM-A- sephadex 25弱碱性、阳离子交换剂CMNa+4.50.5CM- sephadex A-50SP- sephadex A-25强碱性、阳离子交换剂SPNa+2.30.3SP- sephadex A-50离子交换交联葡聚糖有如下优点：不会引起被分离物质的变性或失活；非特异性吸附少；交换容量大。离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般选A50和C50，而低分子量（30 000和高分子量200 000）均宜选用A25和C25。（三）试验方法阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。1剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法2膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml8ml柱床体积。表14 分离的血清与所需DEAE纤维素量及其他条件的大致关系血清样品量（ml）DEAE需用量（g）选层析柱规格（cm）选脱液量（ml）1221251001505521220030010102203004002020237400800称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。3平衡 将DEAE纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。4装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为101201，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。 装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。5上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。 样品的加量与DEAE纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的 球蛋白50mg100mg，用干重约4g DEAE纤维素装柱分离，可获得理想结果。6洗脱 对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使pH逐渐降低，而离子浓度逐渐升高。一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确。表15 血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系成 分等电点DEAE吸附能力解吸顺序白蛋白蛋白蛋白蛋白IgG4.885.065.126.85-7.507.40强弱后先表16 血清的分段洗脱成分NaCl浓度（Mol/L）0.01Mol/L PB（pH）洗脱部分0.0258.0IgG0.0307.0IgG0.0407.0运铁蛋白、纤维蛋白原0.0606.5白蛋白、IgA0.1506.5IgM 白蛋白表17 各种Ig解脱吸附条件不加NaCl PB离子强度（Mol/L）pHIg其他0.018.0IgG0.0258.0IgE0.0357.0IgA0.0405.9球蛋白0.105.8白蛋白0.405.24.5IgM球蛋白7洗脱液的收集 利用自动分步收集器收集，并以20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。8交换柱的再生 将使用过的DEAE纤维素移入烧杯中，用2Mol/L NaCl液浸泡，抽滤并洗涤数次。如不立即使用，可加1/10 000的叠氮钠防腐，保存于4冰箱中。使用时，再以碱酸碱处理液相色谱中采用梯度洗脱,目的：缩短的时间；提高分离效果。梯度洗脱：流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子k，并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。梯度洗脱特点：提高柱效改善检测器的灵敏度当样品中的一个峰的k值和最后一个峰的k值相差几十倍至几百倍时，使用梯度洗脱效果特别好。梯度洗脱中为保证流速的稳定，必须使用恒流泵，否则难获重复结果。梯度洗脱常用一个弱极性的溶剂A和一个强极性的溶剂B。梯度范围：指流动相中强溶剂分别在起始液和终止液中的浓度。调节梯度范围对得到最佳的梯度分离起重要作用。最佳梯度范围：第一个峰处分时间大约为2倍的t0，梯度结束时把最后一个峰洗脱出来。梯度洗脱的形式线形梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化与梯度时间成线性比例。在一定时间内流动相强度越大，直线斜率越大。指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度岁梯度时间变化称指数关系 。凹形：梯度起始阶段强度变化缓慢，随时间增加，强度变化加快。凸形：起始阶段梯度速度变化快，终止阶段梯度速度变化慢。折线形： 选择适当的A,B溶剂强度：A溶剂为低强度；B溶剂为高强度，B溶剂的强度应能够在梯度过程中使所有欲测谱带都能被洗脱，并使各