dna提取4.doc

从动物组织中提取基因组DNA（一）实验目的通过实践操作与实验实践掌握从动物组织中提取DNA的基本原理和基本方法。 (二)实验原理在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K笑话细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA，用此法得到的DNA长度为100-150kb，适用于噬菌体构建基因组文库和DNA印迹分析。（三）试剂、材料、仪器与器材1).试剂与材料1)TrisHCL1mol/LPH8.050ml配制方法：40ml双蒸水，6.057g固体Tris放入烧杯中溶解，用浓盐酸调PH值到8.0，转移到50ml容量瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。2)生理盐水:0.85%NaCL100ml配制方法：在20ml双蒸水中溶解0.85g固体NaCL，加水定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。3)EDTA0.5mol/LPH8.050ml配制方法：将9.08g的EDTANa22H2O溶解于40ml双蒸水，用1g的NaOH颗粒（慢慢逐步加入）调PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA难溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTANa22H2O。4)TES缓冲液（释放DNA）100ml配制方法：将0.5844g的5mol/lNaCl溶解于80ml双蒸水，在分别加入1ml的0.5mol/lEDTA、0.2ml的Tris-HCl(pH=8.0)，加定容至100ml,摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。5)10%SDS（变性剂破细胞壁）100ml配制方法：将10g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80ml双蒸水于68加热溶解，用浓HCl调至PH=7.2，定容至100ml，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4保存备用。6)蛋白酶K（降解蛋白质）：20mg/mL无菌三蒸水溶解。7)RNA酶（降解RNA）（选配）配制方法：将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的TrisCL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的浓度，于100加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份存于20。8)氯仿：异戊醇=24：1 100ml按24:1的比例加入氯仿、异戊醇，摇匀，转到准备好的瓶中，贴上标签，4保存备用。9)TE缓冲液（溶解DNA）PH8.050ml配制方法：将0.5ml的10mmolTris-HCl(PH8.0)、0.1ml的0.5mol/lEDTA (PH8.0)加入到50ml的容量瓶中，调PH8.0定容至50ml摇匀后，转到准备好的瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4保存备用。2.仪器与器材移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、恒温水浴箱。（四）操作步骤1.组织块解冻，取适量组织于PBS溶液中清洗干净后放入装有500微升PBS的离心管中（1.5ml），用剪刀剪碎；12000rpm离心8min，取出弃上清；2.加入0.45mlTES混匀，再加入50ulSDS（10%），20ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56保温4-6h，每2h摇1次,至体系透亮为好。3.放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），上下温柔翻转5min,12000r/m，离心10min，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。4.加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下温柔翻转5min，12000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。5.加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），上下温柔翻转5min， 10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。6.加入1/10体积的NaAc（4保存），加入2倍体积的-20预冷的无水乙醇沉淀DNA，置于-20中保存30min或更久；观察现象。7.12000r/m，离心10分钟，弃乙醇。8.-20保存的75%乙醇洗涤，12000r/m，离心5分钟，去乙醇， 55干燥DNA。9.加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定）（一般50L），-20保存备用。如果除去其中的RNA，可加5lRNaseA(10g/l),37保温30min，用苯酚抽提后，按步骤9和10重沉淀DNA。（五）注意事项1.要充分除去DNA提取液中的苯酚，否则会影响以后的操作。2.用酚-氯仿-异戊醇（体积比为25：24：1）抽提后取上清是不能将中间的蛋白质扰动，以防蛋白质污染。3.酚-氯仿-异戊醇中的异戊醇是用来消除实验中可能产生的