分子复习资料重点.doc

1、 真核生物启动子对转录的影响启动子分为上游启动子元件和TATA区。TATA区使转录精确地起始;上游启动子元件的存在与否，对该启动子的生物活性有着根本性的影响，主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。2、 真核生物RNA的转录后加工的过程是指将各种前体RNA分子加工转变成有功能的、成熟的RNA的过程。 tRNA前体的加工：剪接内含子；3端添加-CCA-OH结构；修饰核苷酸。 rRNA前体的加工：在5端切除非编码的序列，生产41S中间产物；41S RNA再被切割为两段，一段为32S，一段为20S；32S RNA进一步被剪切成28S rRNA和5.8S rRNA；20S RNA被剪切生成18S RNA。3、 RNA编辑的生物学意义 校正作用，有些基因在突变过程中丢失的遗传信息可能通过RNA的编辑得以恢复。 调控翻译，通过编辑可以构建或去除起始密码子和终止密码子，是基因表达调控的一种方式。 扩充遗传信息，能使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物的进化。4、 核酶分子的组成和分类。同一核酶分子由具有催化中心的核酶和含有剪切位点的底物部分共同组成锤头结构，具有自我剪切能力的RNA大多数都能形成锤头结构，该二级结构由三个茎（、）构成，茎区是由互补碱基构成的局部双链结构，包围着一个由1113个保守核苷酸构成的催化中心。可以分为剪切型核酶和剪接型核酶。5、 密码子的摆动配对现象根据摆动假说，在密码子与反密码子的配对中，前两对严格遵守碱基配对原则，第三对碱基有一定的自由度，可以摆动，因而使某些tRNA可以识别1个以上的密码子。一个tRNA能识别多少个密码子是由反密码子的第一位碱基的性质决定的。6、 tRNA的三叶草形二级结构 受体臂：结合氨基酸的位点，主要由链两端序列碱基配对形成的杆状结构和3端未配对的34个碱基所组成。 TC臂：根据3个核苷酸命名，其中表示拟尿嘧啶。 反密码子臂：位于套索中央的三联反密码子。 D臂：含有二氢尿嘧啶。7、 tRNA的L型三级结构保留了二级结构中由于碱基互补而产生的双螺旋杆状结构，又通过分子重排创造了另一对双螺旋。主要由在二级结构中未配对碱基间形成氢键（三级氢键）而引发的。8、 起始tRNA和延伸tRNA的区别有一类能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始RNA，其他RNA统称为延伸RNA。原核生物起始tRNA 携带甲酰甲硫氨酸，真核生物起始tRNA携带甲硫氨酸，延伸tRNA没。9、 氨酰-tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶，既能识别tRNA，又能识别氨基酸，使氨基酸与对应的tRNA相结合，它对两者都具有高度的专一性。11、核糖体的构成、功能以及起始。核糖体是一个致密的核糖核蛋白颗粒，可以解离为两个亚基，每个亚基都含有一个相对分子质量较大的rRNA和许多不同的蛋白质分子。核糖体上有许多个活性中心，每个中心都由一组特殊的核糖体蛋白构成。有3个tRNA结合位点。在多肽合成过程中，不同的tRNA将相应的氨基酸带到蛋白质合成部位，并与mRNA进行专一性的相互作用，以选择对信息专一的AA-tRNA。有多个结合位点。小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，大亚基负责携带氨基酸及tRNA。10、 二硫键形成的作用是蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的，用来稳定蛋白的天然构象。11、 翻译-运转同步机制：分泌蛋白 信号肽假说：完整的信号肽是保证蛋白质运转的必要条件。仅有信号肽还不足以保证蛋白质运转的发生。信号肽的切除并不是所有运转所必需的。并非所有的运转蛋白质都有可降解的信号肽。 分泌蛋白质的合成和胞吐作用?12、 翻译后运转机制线粒体蛋白质跨膜运转：通过线粒体膜的蛋白质在运转之前大多数以前体形式存在。蛋白质通过线粒体内膜的运转是一种需要能量的过程。前导肽：拥有前导肽的线粒体蛋白质能够跨膜运转进入线粒体，在这一过程中前导肽被水解，前体转变为成熟蛋白，是去继续跨膜能力。 叶绿体蛋白质的跨膜运转：活性蛋白水解酶位于叶绿体基质内。叶绿体膜能够特异性地与叶绿体蛋白的前体结合。叶绿体蛋白质钱体内可降解序列因职务和蛋白质种类不同而表现出明显的差异。13、 重组DNA技术重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。技术路线为提取目的基因，目的基因与运载体结合，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测，目的基因的表达。重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。DNA连接酶通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，从而修复缺口或催化黏合完全分离的两个DNA分子。载体具有自主复制能力，一般为病毒、噬菌体和质粒等小分子质量复制子。DNA操作技术14、 细菌转化细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致形状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株称作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则成为受体菌株。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进行一些物理或化学处理，以增加他们获取DNA的能力。经历了这种处理的细胞被称为感受态细胞。细菌转化的常用方法有CaCl2法和电击法。CaCl2法是制备大肠杆菌感受态最常用的方法。将快速生长的大肠杆菌置于低温（0）预处理的低渗CaCl2溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成复合物。15、 聚合酶链式反应技术（PCR）PCR可能是体外快速扩增特定基因或DNA序列最常用的方法。技术原理是首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷酸合成新生的DNA互补链。整个PCR过程中，变性退火延伸不断重复，多次循环。16、 基因组DNA文库的构建把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别于载体组合，导入微生物细胞，形成克隆，基因组中所有DNA序列克隆的总汇被成为基因组DNA文库，常被用于分离特定的基因片段、分析特定基因结构、研究基因表达调控，全基因组物理图谱的构建、全基因组序列测定等。步骤为随机DNA片段获得，与载体（噬菌体）DNA连接，包装，感染大肠杆菌，筛选。RNA基本操作技术17、 总RNA的提取实验室最常用的方法是异硫氰酸胍-苯酚（Trizol）抽提法。RNA的浓度和纯度可以通过测定OD260和OD280来判断。OD260/OD280 比值如果为1.82.0，表示所提取的RNA浓度较好。18、 mRNA的纯化实验室常用寡（dT）-纤维素柱层析法获得高纯度的mRNA，该方法的利用mRNA3末端含有poly（A）的特点，当RNA流经寡（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。19、 基因文库的筛选主要筛选方法分为核酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的方法之一，长用放射性标记的特异DNA探针进行高密度的菌落杂交筛选。PCR筛选法与核酸杂交筛选法具有同样的通用性，而且操作简单，但前提是已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。20、 RACE技术（cDNA末端快速扩增法）是一项在已知cDNA序列的基础上克隆5端或3端缺失序列的技术，即在很大程度上依赖于RNA连接酶连接或寡聚帽子的快速扩增。只要步骤：获得高质量的总RNA；去磷酸化作用；取掉mRNA5端的帽子结构加特异性RNA寡聚接头并用RNA连接酶相连接；以特异性寡dT为引物，在反转录酶的作用下，反转录合成第一条cDNA链，包含了寡接头的互补序列；分别以第一链cDNA为模板进行RACE反应。基因表达研究技术21、 原位杂交技术（ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。通常分为RNA原位杂交和染色体原位杂交（荧光原位杂交，FISH）。22、 基因定点突变技术原理为通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位点等。科学家主要采用两种PCR方法，即重叠延伸技术和大引物诱变法。（过程太多，P210）蛋白质及RNA相互作用技术23、 酵母单杂交系统基本原理是首先将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游，然后将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin其粽子，使报告基因得到表达。功能为识别稳定结合于DNA上的蛋白质；可在酵母细胞内研究真核生物钟DNA-蛋白质间的相互作用（能否相互结合）；并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因；是分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用的有效方法。其他分子生物学技术24、 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）基本原理是被测蛋白只能与标记的特异性抗体相结合，而这种结合不改变该蛋白在凝胶电泳中的相对分子质量。具有高效、简便、灵敏等特点。分为五个步骤：蛋白样品的准备；SDS-PAGE电泳分离样品；将已分离的蛋白转移到尼龙或其他膜上，转移后首先将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附；用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与对应的非标记抗体（一抗）结合；洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。25、 原核基因表达调控分类根据调控机制的不同可分为负转录调控和正转录调控。在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白，起着阻止结构基因转录的作用，根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏两大类。在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白，根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导系统和正控阻遏系统。真核基因表达调控26、 真核基因（断裂基因）的断裂结构大多数真核基因都是由蛋白质编码序列和非蛋白质编码序列两部分组成。编码序列称为外显子，非编码序列称为内含子。真核基因断裂结构的一个重要特点是外显子-内含子连接区的高度保守性和特异性碱基序列。外显子-内含子连接区是指外显子和内含子的交界或称边界序列，他有两个重要特征：内含子的两段序列之间没有广泛的同源性，因此内含子两段序列不能互补；外显子-内含子连接区序列虽然很短，但却是高度保守的，因此，改序列可能与剪接机制密切相关。GT-AT法则：序列分析表明，几乎每个内含子5端起始的两个碱基都是GT，而3端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的高度保守性和广泛性，即：5（左剪接位点/供体位点）GTAG3（右剪接位点/受体位点）。外显子和内含子的可变调控有组成型剪接和选择性剪接27、 DNA甲基化与X染色体失活的关系DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。32228、 组蛋白乙酰化及去乙酰化对基因表达的影响组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶通过使组蛋白乙酰化和去乙酰化对基因表达产生影响。组蛋白N端尾巴上赖氨酸残基的乙酰化中和了组蛋白尾巴的正电荷，降低了它与DNA的亲和性，导致核小体构象发生有利于转录调节蛋白与染色质相结合的变化，从而提高了基因转录的活性。核心组蛋白H2A,H2B,H3，H4通过组蛋白尾部选择性乙酰基化影响核小体的浓缩水平和可接近性。同时，组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶只能有选择地影响一部分的基因转录。29、 基因沉默基因沉默（RNA沉默）是指真核生物中由双链RNA诱导的识别和清除细胞中非正常RNA的一种机制。可分为转录水平基因沉默和转录后基因沉默。30、 基因治疗中病毒载体的分类 重组型病毒载体。 无病毒基因的病毒载体：以反转录病毒为例说明五病毒基因的病毒载体构建过程。、31、 常用病毒载体的特性和适用范围P40232、 基因治疗中的问题 靶向性基因导入系统：必须将治疗基因送入特定的靶细胞，并在该细胞中得到高效表达。 外源基因表达的可控性 治疗基因过少核内不均一RNA：由DNA转录生成的初级转录产物，是mRNA的前体。RNA的编辑：是某些RNA，特别是mRNA前体的一种加工方式，如插入、删除或取代一些核苷酸残基，导致DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。核酶：一类具有催化功能的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。简并：由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象。同工tRNA：几个代表相同氨基酸的tRNA。既要有不同的反密码