生物化学实验讲义 2011.doc

生物化学实验讲义 石河子大学生命科学学院 生物化学实验基本要求v一、生物化学实验室规则 v1. 每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。v2. 实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。实验过程中要严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字简练、准确，要求同学们记录完整准确的实验数据，养成良好的实事求是的工作作风和求真务实的科学态度，严禁伪造实验数据，弄虚作假。v3. 实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐，公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器须洗净放好，将实验台面抹试干净，才能离开实验室。v4. 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心细致，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教员，不得擅自动手检修。 v5. 实验室内严禁吸烟！煤气灯应随用随关，严格做到：人在火在，人走火灭。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。实验完毕，应立即关好煤气开关和水笼头，拉下电闸。离开实验室以前应认真、负责地进行检查，严防发生安全事故。v6. 所有实验用的废液，废弃物等，都要收集在适当的容器内，加以储存再处理，不能倒在水槽内或到处乱扔。 v7. 仪器损坏时，应如实向教员报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。 v8. 实验室内一切物品，未经本室负责教员批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。v9. 每次实验课由班长负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的卫生、安全和一切服务性的工作及填写实验情况登记卡和实验记录。二、实验报告要求及格式 v实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。v下面简单介绍实验报告的格式。 （实验名称） 姓名 学号 日期目的和要求 原理 试剂配制及仪器 操作方法 实验结果 v讨论与分析 v 在实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂配制及仪器）和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始实验数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验结果的图表等。另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分可以包括：关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象以及思考题，进行探讨；对于实验设计的认识、体会和建议；对实验课的改进意见等。三、生物学实验室常用仪器使用方法与保养1、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中，都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机已成为分子生物学研究中必需的重要工具。 使用方法： (1）离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器处于水平位置以免离心时造成机器震动。 (2).打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先以托盘天平平衡好的样品放置于转头样品架上（离心筒须与样品同时平衡），关闭机盖。 (3).按功能选择键，设置各项要求：温度、速度、时间、加速度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。 (4).按启动键，离心机将执行上述参数进行运作，到预定时间自动关机。 (5).待离心机完全停止转动后打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。 注意事项： (1).机体应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线。 (2).开机前应检查转头安装是否牢固，机腔有无异物掉入。 (3).样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。 (4).挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏，以免腐蚀机腔或造成事故。 (5).擦拭离心机腔时动作要轻，以免损坏机腔内温度感应器。 (6).每次操作完毕应作好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。 (7).离心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。 附：相对离心力与每分钟转速的换算 离心机的转速，在以前实验资料中一般以每分钟多少转来表示。由于离心力不仅为转速函数，亦为离心半径的函数，即转速相同时，离心半径越长，产生的离心力越大。因此仅以转速表达离心力是不够科学的，近年来主张用相对离心力（RCF）来表示比较合理。现在国际资料中，已改用相对离心力来表示。 2、分光光度计 不同物质对不同波长入射光的吸收程度各不相同，从而形成特征性的吸收光谱。分光光度法不仅适应于可见光区，同时还可扩展至紫外光区及红外光区，因此给科研实验带来了极大方便。下面重点介绍分光光度计的使用及注意事项。 使用规则 (1).接通稳压器电源，待稳压器输出电压稳定至200V后打开光度计电源，仪器自动进入初始化。 (2).初始化约需时10 min，内容包括：寻找零级光；建立基线；最后当显示器指示nm时，表明仪器完成初始化程序，可进入检测状态。 (3).按要求输入各项参数，选择相应比色杯（玻璃或石英），将空白管、标准管及待测管依次放入比色皿架内，关上比色池盖。 (4).以空白管自动调零。 (5).试样槽依次移至样品位置，待数据显示稳定后按“START/STOP”键，打印机自动打印所测数据，重复上述步骤，直到所有样品检测完毕。 (6).检测结束后应及时取出比色杯，并清洗干净放回原处，同时关上仪器电源开关及稳压器电源开关，做好使用情况登记。 注意事项 (1).仪器初次使用或使用较长时间（一般为一年），需检查波长准确度，以确保检测结果的可靠性。 (2).由于长途运输或室内搬运可能造成光源位置偏移，导致亮电流漂移增大。此时对光源位置进行调整，直至达到有关技术指标为止。若经调整校正后波长准确度、暗电源漂移及亮电流漂移三项关键指标仍未符合要求，则应停止使用，并及时通知有关技术人员检修。 (3).每次检测结束后应检查比色池内有否溶液溢出，若有溢出应随时用滤纸吸干，以免引起测量误差或影响仪器使用寿命。 (4).仪器每次使用完毕，应于灯室内放置数袋硅胶（或其它干燥剂），以免反射镜受潮霉变或沾污，影响仪器使用，同时盖好防尘罩。 (5).仪器室应通常保持洁净干燥，室温以5-35为宜，相对温度不得超过85%。有条件者应于室内配备空调机及除湿机，以确保仪器性能稳定。 (6).仪器室不得存放酸、碱、挥发性或腐蚀性等物质，以免损坏仪器。 (7).仪器长时间不用时，应定时通电预热，每周1次，每次30min，以保证仪器处于良好使用状态3、电泳仪： 电泳技术是生物化学与分子生物学研究不可缺少的重要分析手段。电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类，自由界面电泳不需支持物，如等电聚焦电泳、等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电泳目前已很少使用。而区带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶-G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶电泳。所谓电泳，是指带电粒子在电场中的运动，不同物质由于所带电荷及分子量的不同，因此在电场中运动速度不同，根据这一特征，应用电泳法便可以对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组份分析或单个组份提取制备，这在临床检验或实验研究中具有极其重要的意义。电泳仪正是基于上述原理设计制造的。使用方法 (1).首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。 (2).电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。 (3).接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。 (4).工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头。 注意事项 (1).电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。同时要求仪器必须有良好接地端，以防漏电。 (2).仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以防短路现象发生，虽然仪器内部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。 (3).由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。 (4).在总电流不超过仪器额定电流时（最大电流范围），可以多槽关联使用，但要注意不能超载，否则容易影响仪器寿命。 (5).某些特殊情况下需检查仪器电泳输入情况时，允许在稳压状态下空载开机，但在稳流状态下必须先接好负载再开机，否则电压表指针将大幅度跳动，容易造成不必要的人为机器损坏。 (6).使用过程中发现异常现象，如较大噪音、放电或异常气味，须立即切断电源，进行检修，以免发生意外事故。4、分析天平： 分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要仪器，充分了解仪器性能及熟练掌握其使用方法，是获得可靠分析结果的保证。分析天平的种类很多，有普通分析天平、半自动/全自动加码电光投影阻尼分析天平及电子分析天平等。操作方法 (1).检查并调整天平至水平位置。 (2).事先检查电源电压是否匹配（必要时配置稳压器），按仪器要求通电预热至所需时间。 (3).预热足够时间后打开天平开关，天平则自动进行灵敏度及零点调节。待稳定标志显示后，可进行正式称量。 (4).称量时将洁净称量瓶或称量纸置于称盘上，关上侧门，轻按一下去皮键，天平将自动校对零点，然后逐渐加入待称物质，直到所需重量为止。 (5).被称物质的重量是显示屏左下角出现“”标志时，显示屏所显示的实际数值。 (6).称量结束应及时除去称量瓶（纸），关上侧门，切断电源，并做好使用情况登记。 注意事项 (1).天平应放置在牢固平稳水泥台或木台上，室内要求清洁、干燥及较恒定的温度，同时应避免光线直接照射到天平上。 (2).称量时应从侧门取放物质，读数时应关闭箱门以免空气流动引起天平摆动。前门仅在检修或清除残留物质时使用。 (3).电子分析天平若长时间不使用，则应定时通电预热，每周一次，每次预热2h，以确保仪器始终处于良好使用状态。 (4).天平箱内应放置吸潮剂（如硅胶），当吸潮剂吸水变色，应立即高温烘烤更换，以确保吸湿性能。 (5).挥发性、腐蚀性、强酸强碱类物质应盛于带盖称量瓶内称量，防止腐蚀天平。实验一 蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G-250染色法 一、实验目的： 1、学习、掌握利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理及方法； 2、掌握分光光度计的使用方法； 3、掌握标准曲线的绘制。二、实验原理:蛋白质含量测定依法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。双缩脲法：原理是蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子质量及aa成分无关，故可以用来测定蛋白质含量；Folin-酚试剂法（Lowry法）： 是双缩脲法的发展，第一步涉及到碱性溶液中铜蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原磷钼酸磷钨酸试剂，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）比双缩脲法灵敏，但费时；紫外吸收法：蛋白质中一些氨基酸残基中的苯环含有共轭双键，所以蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm处，在一定范围内，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质含量成正比，可用作定量测定，简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干扰。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用蛋白质的存在会影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收，在此基础上发展了蛋白质染色测定方法涉及的甲基橙、考马斯兰亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中，游离状态下为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，蛋白质染料复合物对595nm可见光有最大光吸收，在一定范围内（10-1000g/ml）其OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：绿豆芽2、仪器：S-22pc可见光分光光度计；研钵；离心机等3、试剂：（1）染色液：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml（2）标准蛋白质溶液：浓度0.5mg/ml的牛血清白蛋白。 四、实验步骤： 1、制作标准曲线： 取7支试管，依次分别加入0.0；0.10；0.15；0.20；0.30；0.40；0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，置室温下放置5分钟。然后测各管的O.D595nm值，以O.D值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。表1、制作标准曲线加样表： 编号1(空白）23456样品标准蛋白(ml)0.00.10.20.30.40.50.5水(ml)0.50.40.30.20.10.0浓度(mg/ml)0.00.050.10.150.20.25X染色液(ml)5555555吸光度值（A）2、样品蛋白质提取： 称取绿豆芽下胚轴1g，放入研钵中，加少量石英砂和2ml水，研成匀浆，转入离心管，再用水分三次冲洗研钵(每次4ml)，均转入同一离心管 。等重后3500转/分钟，离心15分钟，取上清液转入25ml容量瓶，用水定容(样品提取液)。3、测定： 吸取0.5ml样品提取液于试管中,加入考马斯亮蓝G-250 染色液5ml，充分混匀，放置5分钟，测A595nm，记录结果，查标准曲线，得蛋白质浓度X (g/ml)。五、计算： 样品蛋白质含量（g/g）=X提取液的总体积/ 样品鲜重(g) 六、思考题： 1、简答下列三种测定蛋白质含量的方法及其原理？（1）双缩脲法；（2）Folin-酚试剂法； （3）紫外吸收法。2、什么叫分光光度法。 分光光度技术 1、定义：利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法。使用的仪器称为分光光度计。2. 朗伯比尔（Lambertbeer）光吸收定律： AlgTb c（1）A吸光度，又称光密度“O.D”。（2）T透光度， TI / I。（I。为照射到吸收池上的光强，I为透过吸收池的光强）。（3）摩尔吸光系数（Lmol 1cm1）。（4）b样品光程（cm），通常b=1cm。（5）C样品浓度（mol/L）。实验二 过氧化氢酶活性的测定碘量法一、 实验目的：1、掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原理和方法；2、了解过氧化氢酶的作用。二、实验原理：植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可进一步生成氢氧自由基（OH）。氢氧自由基（OH）是化学性质最活泼的活性氧，可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并且有非常高的速度常数，破坏性极强，可使细胞膜遭受损害，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶(catalase；CAT)可以清除H2O2、分解氢氧自由基，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活，因此CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的抗逆性密切相关。CAT活性大小以一定时间内分解的H2O2量来表示：在一定条件下，CAT能把H2O2分解为H2O和O2。当CAT与H2O2反应一定时间(t)后，再用碘量法测定未分解的H2O2，以钼酸铵作催化剂，H2O2与KI反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，反应式为：H2O2（余）+2KI+H2SO4I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O3 2NaI+Na2S4O6（连二硫酸钠）。用硫代硫酸钠分别滴定空白液(可求出总的H2O2量)和反应液(可求出未分解的H2O2量)，再根据二者滴定值之差求出分解的H2O2量。三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：三叶草2、仪器：(1) 滴定管 (2)研钵 (3) 容量瓶 (4)移液管(1ml) (5)三角瓶(100ml)3、试剂：（1）0.05M H2O2 （2）0.2M Na2S2O3 （3）1.8M H2SO4 （4）1%淀粉溶液 （5）10%（NH4）6Mo7O24 （6）20% KI （7）CaCO3，石英砂四、实验步骤： 1、酶液提取： 称取0.5g三叶草，加少量石英砂，CaCO3，2ml水，研成匀浆，移入100ml容量瓶，冲洗研钵数次，过滤，定容，静置待用。 2、酶促反应： （1）取锥形瓶2个，编号A，B，各加入10ml酶液，之后立即向A瓶中加入1.8mol/L H2SO45ml，终止酶活性，作空白滴定。（2）向A，B两瓶各加H2O2 5ml，摇匀，在加入B瓶那一刻起，记录时间，5分钟后迅速向B瓶中加入1. 8mol/LH2SO45ml，终止酶活性。3、滴定：向A，B两瓶各加1ml 20% KI 和3滴（NH4）6Mo7O24，摇匀后迅速加入5滴1%淀粉溶液，用Na2S2O3进行滴定至蓝色恰好消失，记录两次消耗Na2S2O3的体积VA(空白)，VB(反应液)。酶活性测定 管号酶液(ml)1.8M H2SO4(ml)0.05M H2O2(ml)室温1.8MH2SO4(ml)20% KI溶液(ml)钼酸铵溶液(滴)淀粉溶液(滴)0.1MNa2S2O3溶液的滴定量A空白10555分钟-135VA(空白)=B反应10-55135VB(反应液)=五、实验结果与计算：1、被分解的H2O2量（mg）= VA(空白) -VB(反应液) Na2S2O3摩尔浓度172、CAT活性（mg.g-1.min-1）= 被分解的H2O2量（mg）(总体积测定取液量) /品重（g）时间（min）六、思考题 ：本实验中影响CAT活性测定的因素有哪些？实验三 动物肝脏DNA的制备和鉴定一、实验目的：1、学习并掌握动物组织DNA的提取方法及其原理。2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。3、学习核酸染色的方法。 二、实验原理:1脱氧核糖核酸（DNA）的制备。脱氧核糖核酸（DNA）在细胞内部都与蛋白质结合成复合物形式存在，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。除去蛋白质主要有2种：（1）用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。（2）用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。 脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2molL）溶液中溶解度很大，但在0.14molL NaCl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白则溶于0.14molL NaCl溶液中(当然也溶于浓NaCl（1-2molL）溶液中)，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性。加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。2脱氧核糖核酸（DNA）的分离鉴定琼脂糖凝胶电泳技术（1）电泳定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。根据电泳支持介质的不同，可分为滤纸，醋酸纤维薄膜，淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。电泳技术的应用非常广泛，从分离小分子如氨基酸、肽、激素、核苷酸到复杂的大分子如蛋白质、核酸甚至病毒颗粒的分离鉴定都依赖于电泳技术。（2）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（电荷效应） 。DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的分子筛效应）。电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的确切位置。溴乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出波长为590nm的红橙色荧光。溴乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含EB的溶液中浸泡，但小分子DNA浸泡时间过长容易引起扩散。溴乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。（3）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素 核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比( 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA(当琼脂糖浓度太高时，环状DNA不能进入胶中)。 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行电泳分离。（4）琼脂糖凝胶电泳具有以下优点： 操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度快、分离DNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。 凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光检测及定量测定。 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。3 DNA荧光染料EB染色的原理和优点是（1）、原理： EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐(Ethidium Bromide)。 EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸双链配对碱基或碱基对之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧光。 激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收254nm的紫外线后将能量传递给EB，二是EB本身吸收302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EB发射波长为590nm的可见光（红橙区）。（2）、优点： 染色比较简便、快捷，一般在1015min就可反应。 EB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做到的。 EB灵敏度高，可检测出10ng或更少的DNA含量。 既可用于DNA也可用于RNA的检测。 EB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外灯检测电泳的进程和效果。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光比游离的EB强10倍， 因此不需洗净凝胶中游离的EB也可检测出DNA的条带。（3）、缺点： 溴乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行处理。每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭，室温下放置1小时，不时的摇动，用新华一号滤纸过滤，弃滤液，用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。*溴乙啶在260分解，在标准条件下进行焚化后不会有危险性。三、实验材料、仪器和试剂: 1实验材料： 动物肝脏 2仪器（1）研钵（2）离心管（3）移液管（4）吸管（5）稳压稳流电泳仪（6）可调微量移液器（7）水平电泳槽（8）暗箱紫外透射仪等。3试剂（1）0.14molLNaCl0.15molL EDTA-Na溶液：（2）20SDS溶液：（3）氯仿一异戊醇(24:1)混合液：（4）95乙醇溶液。（5）80乙醇溶液。 （6） pH8.0TE缓冲液：10 mmolLTrisHCI，lmmolL EDTA，其中含RNA酶20ugmL。（7）电泳缓冲液：Tris-硼酸EDTA（50TBE）pH8.3。（8）加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（BPB）40%蔗糖。（9） 溴化乙锭（EB）溶液：10g/ml。 （10）琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。 四、实验步骤1动物肝脏DNA的制备（1）取新鲜动物肝脏，除去结缔组织，用0.14molL NaCl0.15molL EDTA溶液洗去血液。在冰浴中切成小块，称取10g，加入两倍体积0.14molL NaCl0.15molL EDTA溶液，于研钵中研磨至匀浆，以3000rrnin的转速离心 10min。（2）在上述沉淀物中加入0.14molL NaCl0.15molL EDTA溶液，使总体积为 20mL，然后在60下，滴加 20SDS溶液1mL，边加边搅拌，再摇动 10min，使核酸与蛋白质分离。（3）边搅拌边加固体氯化钠2g，使其最终浓度达到l.4molL，再摇10min。（4）加等体积的氯仿一异戊醇，轻混，静置，则变性蛋白凝胶界于两层之间，吸出上清液。（5）加1/2体积的氯仿一异戊醇混合液，振摇20min，以3000rmin的转速离心10min。离心管内的物质分为三层，上层为含DNA的水相层，下层为氯仿一异成醇混合物，中间层为变性蛋白凝胶。（6）吸出上清液，加入2倍体积95乙醇溶液（预冷），产生沉淀。a用玻棒搅拌， DNA的丝状物即缠在玻棒上，用80乙醇溶液离心洗涤；b再以4000rmin的转速离心溶液10min，弃去上清液，沉淀用80乙醇溶液离心洗涤。（7）将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥后，加入1ml TE缓冲，使DNA充分溶解，置-20贮存，待用。 2琼脂糖凝胶电泳（1）凝胶板的制备：a取琼脂糖0.7 g，加1TBE缓冲溶液100ml，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的琼脂糖胶液。b胶床两头贴上防水胶带，形成8mm高的挡墙，压 紧胶带，置水平台面上。c插入梳子，梳齿下端离板底0.51mm。d将60凝胶不间断倒入胶床，高34mm，避免气泡，室温下凝固。e完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面12mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。（2）加样：将样品DNA溶液与加样缓冲液以5 ：1的体积比混合，用微量进样器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量1520 ml （加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部）。（3）电泳： 为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电压(80V)，样品一进入胶内则将电压调至5V/cm 。当染料前沿移至底边1-2mm时，电泳毕。（4）染色、观察、显微照相与记录：关闭电源，取出胶床，浸入0.5g/mL的EB溶液中，30min后取出。在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA（红橙色荧光），并进行显微照相。五、注意事项：核酸提取过程中的注意事项：1避免过酸过碱或高温环境，合适的T：0-4，pH4-9；2防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；3防止核酸酶的降解作用，可加入抑制剂EDTA，柠檬酸钠；4整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。六、作业：绘制DNA电泳图谱七、思考题：荧光染料EB染色的原理和优缺点是什么?实验四 POD同工酶的提取及电泳检测一、实验目的： 1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法； 2、掌握过氧化物酶(POD)活性测定的原理及方法。d3、了解过氧化物酶(POD)的生物学功能。二、实验原理: 1、过氧化物酶：过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。2、同工酶概念：同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如POD在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。、 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)电泳定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。(2)影响电泳效果的因素：带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。（3）聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。引发产生自由基的方法有两种：化学法；光聚合法。化学聚合：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N、N四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；光聚合：催化剂是核黄素（VB2），在痕量氧存在下，核黄素光解形成无色基，无色基再被氧氧化成自由基，激活单体发生聚合。光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质；网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用；长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。（1）凝胶度：是指100mg凝胶溶液中含有单体（Acr）和交联剂（Bis）的总克数，用T%表示。（2）交联度：是指凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数，用C%表示。一般浓缩胶的浓度为7.5%，分离胶的浓度为10%。聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T(总百分浓度)和C(交联百分浓度)。第一、三个不连续性：凝胶孔径的不连续；缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续；在电场中形成的电位梯度的不连续。第二、不连续系统中的三种物理效应：电荷效应：分子筛效应:浓缩效应: 不连续PAGE电泳胶体系统的组成：在浓缩胶中的三个主要作用角色：甘氨酸: pH=8.9 负电荷 pI=6.7 不带电荷4、过氧化物酶活性测定以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为：该红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。三、实验材料、主要仪器和试剂1材料：植物叶片2仪器：（1）分光光度计；（2）移液管（3）离心机（4 000r/min）；（4）研钵(5)垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）； (6)稳流稳压电泳仪； （7）高速冷冻离心机；（8）电子天平；（9）电冰箱；（10）瓷盘、微量进样器；（11）电热恒温水浴锅；（12） S-22pC可见分光光度计；（13）电炉等 3、试剂：（1）1N HCl：用12N的浓盐酸来配制；（2）分离胶缓冲液（pH8.9的Tris-HCl缓冲液）；（3）浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl缓冲液）；（4）分离胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液）；（5）浓缩胶丙胶贮液（Acr-Bis贮液）；（6）过硫酸铵溶液（NH4)2S2O8,简写Ap：（当天配制）；（7）核黄素溶液；（8）电极缓冲液：（pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液）；（9）40%蔗糖；（10）pH4.7乙酸缓冲液；（11）样品提取液；（12）0.5%的溴酚蓝：0.5g溶于100ml无离子水；（13）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：1g联苯胺加9ml冰醋酸，溶解后加36ml水用时加160ml水加Vc140.8mg加几滴30%过氧化氢原液。联苯胺是致癌物质，称取时应戴手套； 四、实验步骤：1.贮液的配