气液相实验.doc

实验6-6 高效液相色谱法测定栀子根提取液中栀子苷的含量一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的操作。2、了解高效液相色谱法测定栀子苷的基本原理。3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。二、实验原理栀子苷是从茜草科植物栀子的干燥成熟果实中运用高科技生产工艺提取精制而成的产品。栀子苷为环烯醚萜苷类化合物，异名京尼平苷，都梅子素葡萄糖苷去羟栀子苷。栀子苷有多种用途，不同条件的发酵，可以制成天然食用着色剂栀子蓝和栀子红，也是用于治疗心脑血管、肝胆等疾病及糖尿病的原料药物。溶 解 性：易溶于水，溶于乙醇，不溶于石油醚。 性 状：环烯醚萜苷类化合物，对-萘酚、羟肟酸、三氯化铁呈正反应。白色结晶。 药理作用：栀子苷具有缓泻、镇痛、利胆、抗炎、治疗软组织损伤以及抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶等作用。 色 泽：白色、类白色或浅黄色。 口感与气味：无味。用反相高效液相色谱法测定栀子根提取液中栀子苷的含量，将已配制的浓度不同的栀子苷标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间tR和峰高A后，可直接用tR定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定提取液中栀子苷的含量。三、仪器和试剂1、Agilent 1100高效液相色谱仪。2、色谱柱： Zorbax C8，5m，1504.6mm，20L定样环。3、流动相：H2O和CH3OH4、栀子苷标准溶液：准确称取1g，至10ml容量瓶中，加入甲醇溶解至刻度，摇匀，获得浓度为100mg/ml的对照品储备溶液，取对照品储备溶液用甲醇稀释，制成浓度分别为5、10、25、50、100mg/ml的对照品溶液，放入冰箱备用。5、栀子根提取液样品处理：将栀子根洗净、切碎，于45 C烘干12 h。称取10g，加入50 mL甲醇超声提取30min。将残渣过滤，残留物用甲醇清洗2次。精确回收滤液，定容，备用。6、平头微量注射器。四、实验步骤1、开机 (1) 检查流动相、废液瓶和色谱柱；(2)打开打印机和计算机的电源；(3)自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符）；(4) 打开工作站。 2、编辑方法(1) 选择“Method”菜单，然后“EDIT METHOD”依屏幕提示进入以下设定：(a） 泵对话框：设定泵的流速：1.0mL/min；H2O:CH3OH=16%:84% (b）检测器对话框：设定波长250 nm。(2) 单击“Method”菜单，选中“Save Method As”，输入方法名，单击OK。 (3) 从“Run Control”菜单中选择“Sample Info”选项，输入操作者名称，在“Data file”中选择“Manual”或“Prefix”。 (4) 单击Ok，等仪器Ready，基线平稳。 3、进样 (1）用样品洗注射器； (2）先进标准样品，绘制标准曲线； (3）再进栀子根提取液，测定含量。4、分析结束，打印结果报告。5、关闭检测器。6、如果使用缓冲溶液，则先用90%水清洗色谱系统30分钟以上，再用甲醇清洗30分钟以上。7、退出工作站，关闭“CAG Boot Up Server”。8、 依次关闭主机，稳压电源，计算机和打印机。五、结果处理1、确定未知样中栀子苷的出峰时间。2、绘制标准曲线。3、求样品中栀子苷的浓度。六、思考题1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？2、高效液相色谱柱一般可在室温进行分离，而气相色谱柱则必须恒温，为什么？高效液相色谱柱有时也实行恒温，这又为什么？实验6-5 气相色谱定性分析一、实验目的1、了解气相色谱仪的基本结构和工作原理。2、学习和熟悉气相色谱仪的基本操作。 3、了解氢火焰离子化检测器和电子俘获检测器的原理和特点。二、实验原理各种物质在一定的色谱条件（固定相与操作条件等）下有各自确定的保留值，因此保留值可作为一种定性指标。对于简单的多组分混合物，若其中所有待测组分均为已知且它们的色谱峰均能分开，则可将各个色谱峰的保留值与各相应的标准试样在同一条件下所得的保留值进行对照比较，就能确定各色谱峰所代表的物质，这就是纯物质对照法定性的原理。该法是气相色谱分析中最常用的一种定性方法。以保留时间作为定性指标，虽然简便，但由于保留时间的测定受载气流速等色谱操作条件的影响较大，可靠性较差；若采用仅与柱温和固定相种类有关而不受其他操作条件影响的相对保留值ris作为指标，则更适合用于色谱定性分析。相对保留值ris定义为：式中分别为死时间，被测组分i及标准物质s的调整保留时间；为被测组分i及标准物质s的保留时间。 氢火焰离子化检测器（FID）是典型的破坏性、质量型检测器，是以氢气和空气燃烧生成的火焰为能源，当有机化合物进入以氢气和氧气燃烧的火焰，在高温下产生化学电离，电离产生比基流高几个数量级的离子，在高压电场的定向作用下，形成离子流，微弱的离子流（10-1210-8A）经过高阻（1061011）放大，成为与进入火焰的有机化合物量成正比的电信号，因此可以根据信号的大小对有机物进行定量分析。本实验以丙酮作为标准物质，利用保留时间和相对保留值进行甲苯和乙酸乙酯的定性分析。三、仪器与试剂1、Agilent 6890N Network GC system，FID检测器 2、氮气、氢气、空气3、微量注射器：50mL4、 试剂：丙酮、甲苯、乙酸乙酯 5、配制混合试样 在2只10mL的容量瓶内，按1：1的比例分别配制甲苯：丙酮、乙酸乙酯：丙酮溶液，摇匀备用。四、实验步骤 1、开机 (1) 打开气源（按相应的检测器所需气体）；分析化学博客1aW_U(2) 打开计算机；(3) 打开6890N GC电源开关；(4) 待仪器自检完毕，双击Instrument Online图标，化学工作站自动与6890N通讯，此时6890N 显示屏上显示“Loading”。2、编辑方法(1) 从“View”菜单中选择“Method and run control”画面，单击“Show top toolbar”，“Show status toolbar”，“Instrument diagram”, “Sampling Diagram” ，使其命令前有“”标志，来调用所需的界面。(2) 设定参数（a）流动相：氮气，流量为1 mLmin-1；（b）柱温：起始温度：70 C，升温速度5C min-1升至120C，保持1min；（c）气化温度：110 C；（d）检测器温度：170C；（e）进样量：1.0 mL（f）分流比：100：1（g）H2流量40 mLmin-1，空气流量400 mLmin-1，尾吹（N2）流量40 mLmin-1 (3) 单击“Method”菜单，选中“Save Method As”，输入方法名，单击OK。 (4) 从“Run Control”菜单中选择“Sample Info”选项，输入操作者名称，在“Data file”中选择“Manual”或“Prefix”。 (5) 单击Ok，等仪器Ready，基线平稳。3、色谱分析(1) tr的测定 待仪器稳定后，分别吸取上述各种混合溶液1.0mL，依次进样，记录色谱数据。(2) 吸取1.0mL已加入丙酮的未知试样（未知试样与丙酮按其它体积比配制）进样，记录色谱数据。分析化学博客(qxLZ:ETH-L4、关机分析化学博客d*W/D Jg!x (1) 实验结束后，调出一提前编好的关机方法, 此方法内容包括同时关闭FID/NPD/FPD/ECD/ECD/TCD检测器，降温各热源（Oven temp，Inlet temp，Det temp）, 关闭FID/NPD/FPD气体（H2，Air）分析化学博客5z k$Qpgw-H (2) 待各处温度降下来后（低于50），退出化学工作站，退出Windows 所有的应用程序 (3)关闭PC, 关闭打印机电源 (4) 关GC电源，最后关载气。五、数据及处理1、记录实验条件2、记录各色谱图中各组分的保留时间计算各组分的调整保留时间及相对保留时间（以丙酮作标准物质），并把数据列于