参考教案-藻蓝蛋白-血红蛋白.doc

模 块I：生物大分子制备方案设计与实践研究一、教学要求 1掌握生物分离科学的进展、相关项单元操作技术的基本原理。2.掌握实验方案设计的基本原则，学会实验方案设计的基本方法。3熟练地实施设计方案，优化实验条件。4掌握所学技术、方法在生物学研究中的应用。5. 掌握实验数据的统计与处理，学会实验图表的制作方法以及实验结果分析讨论二、教学学时 计划课内64学时，其中讲授8学时、实验研究56学时。计划课外16学时，其中文献综述10学时、以小组为单位答疑2学时，集中论文交流4学时）三、讲授的内容 1蛋白质研究在生物科学学习和研究中的地位，进展。2蛋白质制备的基本思路和原则。3各实验的基本原理，操作步骤和注意事项。4. 标准曲线的制作方法和要求，5在本模块基础上开展蛋白质研究的思路和常用技术、方法。6. 实验设计和实施的基本的基本要求、注意事项。四、研究课题1、蛋白质的提取纯化与鉴定（藻蓝蛋白、血红蛋白）2、多糖的提取与分析（酵母、紫色甘薯、南瓜）3、脂类的提取、纯化与分析（胡萝卜素）4、色素的分离纯化与分析（花青素）5、自选课题（根据科研课题、实验条件、自己的兴趣）五、主要单元操作技术与设备 1、单元操作技术：细胞组织破碎术、离心分离技术、双水相萃取技术、离子交换层析技术、凝胶层析技术、超滤技术、减压蒸馏技术、冷冻干燥技术、分光光度技术、电泳技术等生物分离技术；2、主要设备：烘箱、真空干燥箱、分析天平、电子台秤、超声波细胞破碎仪、粉碎机、超滤器（500ml5000ml）、冷冻离心机（8000-10000rpm，300ml2000ml）、普通离心机（5000rpm，2000ml）、台式离心机（18000rpm,5ml6）冷冻干燥机、-80度冰箱、制冰机、酸度计、电热恒温水浴锅、匀浆机、蛋白质色谱分离系统（核酸蛋白检测仪、部分收集器、蠕动泵、梯度混合器、10-25mm,h300-700mm层析柱）电泳仪及垂直板电泳槽、脱色摇床、紫外-可见光分光光度计、荧光分光光度计、高效液相色谱、气相色谱、凝胶成像系统、250ml和500ml旋转蒸发仪、微量凯氏定氮仪、常量凯氏定氮仪、500-1000W电炉、超声波清洗器、振动混合器、移夜枪（200-5000ul）、层析缸、电吹风等。六、教学组织方式 两人一组，所有实验由学生设计方案，独立完成。七、教学的重点和难点 1、学习的自主性加大，审核学生的实验方案、提供必要的条件。2、讲授部分的难点是进展、制备思路、原则和常用技术、方法的学习。3、本模块涉及的仪器特别多，技术方法多，学习难度较大，力求与理论课的对接、举一反三。八、难点的解决办法：1、认真备课，该讲的讲深、讲透，重点一对一答疑。2、做好设计报告的审核，提前一个月做好仪器检修和药品的准备。3、做好必要的单元操作示教和研究过程的现场指导。九、相关参考书1、孙彦，生物分离工程； 2、严希康，生化分离技术； 3、谭天伟，生物分离技术4、李建武，生物化学原理和方法； 5、生物分离工程实验指导模 块I参考方案1： 血红蛋白的提取纯化与鉴定血红蛋白(Hemoglobin , Hb)是动物血液中的一种由4个亚基组成的多亚基蛋白质。作为体内氧运输的载体具有重要的生理功能。在 Hb 与氧结合及释放过程中 ,体现了别构蛋白各亚基之间相互作用的正协同效应特征 ,具有很强的代表性 ,是研究别构蛋白特性的良好材料。此外 ,Hb 的单亚基结构还与食用肉主要色素蛋白-肌红蛋白(Myoglobin , Mb)的结构非常相似 ,均为血红素蛋白质,具有一个血红素活性中心。只是 Mb 是单亚基结构 ,而 Hb为4亚基结构,相当于Mb的4倍体。Hb和Mb均具有3种天然诱导体构型 ,即氧合型 (Oxy-Hb ; Oxy-Mb) ,还原型(Red-Hb ; Red-Mb)和氧化型(Met-Hb; Met-Mb) 。两种蛋白质的相同构型均具有相同的颜色及相似的光谱学特性。为此 ,也有人用 Hb 作为成本昂贵的 Mb 的代用品来研究食用肉色调变化的规律性。而目前市售的Hb多采用冷冻干燥法制备 ,多为Met-Hb 构型,其纯度较低 ,氧合活性较差 ,且该产品不能进行诱导体构型转化的调制 ,因而不能满足人们对食用肉色调变化进行研究的要求。用丰富而廉价动物血液为原料，通过简便生产工艺制备Hb结晶（该结晶属氧化型）可进行多种诱导体形态的调制 ,调制出的各种诱导体具有类似于天然 Hb 的氧合功能特性 ,保持了别构蛋白与底物结合的正协同效应特点 ,同时 ,具有与天然诱导体形态相同的色调变化规律和光谱学特征。因此 ,可以满足人们进行别构蛋白及食肉色调研究的需求。此结晶具有稳定的理化性质 ,可长期保存。一、教学目的通过血红蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。有利于培养学生的学习兴趣。二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料采用猪抗凝血液,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。1. 2 分析方法1.2.1蛋白质浓度的测定：采用Folin法测定各管中蛋白质的总浓度（试剂方法参考生物化学原理和方法）。1.2. 2 血红蛋白的测定：采用文齐氏液测定血红蛋白的浓度（试剂方法见文齐氏液使用说明）。附：文齐氏液使用说明检测原理：文齐氏液是氰化法（HiCL法）的稀释剂，当血液加入文齐氏液内，将血红蛋白两价铁氧化为三价铁，它再与氰化物结合形成稳定棕红色的氰化高铁血红蛋白，这种溶液在540nm波长的血红蛋白计或绿色滤光片的光电比色计上测定人血液中的血红蛋白浓度。稀释液质控：本品为浓缩试剂，使用时吸10ml浓缩型试剂加蒸馏水至500ml，并装于棕色瓶内。若当天使用后仍有剩余试剂，则应放在48冰箱内保存。如果溶液发生混浊或在750nm波长处比色（蒸馏水做空白管），其吸光度（A值）大于0.003时，则不可继续使用。产品组成和性能：本品由有机表面活性剂、磷酸盐和氰化物组成，溶液呈淡黄色清亮透明，五沉淀物和絮状物。适用范围：该产品适用于氰化法测定人体血液血红蛋白含量时稀释血液用。操作步骤：标定过的吸管准确吸取20微升血液，放入盛有已50倍稀释后的5ml文齐氏液的试管内，吸吸管内至无色，然后摇匀并放置5min，在校正过的血红蛋白计或光电比色计上测定血红蛋白浓度。1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（试剂方法参考生物化学原理和方法） 1.3 血红蛋白的提取分离提取分离实验流程：1.3.1动物血液的收集与处理取动物血液80-100ml，按 1：1 加入抗凝剂肝素（1250U/mL）混匀备用。将抗凝血液分装在4支50ml离心管中，3000 r/min ，4，离心10 min，弃去上清 ,收集红血球。向压积红细胞中加3-5倍量预冷的生理盐水，轻轻搅匀洗涤，3000 r/min ，4，离心10 min，吸出上清液弃去。再用生理盐水如上洗涤3次、最后吸出上清液弃去，收集红血球。1.3.2红细胞的破碎和血红蛋白原液的制备方法一：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,置4冰箱中过夜 ,使其自然溶胀破碎，10000 r/min ，4，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。方法二：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,置-20冰箱中冰冻过夜 , 次日将冰冻红细胞放置室温或37水浴使之融化，摇匀，10000 r/min ，4，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。方法三：将洗涤后的红细胞加2倍量的纯水 ,超声波破碎，破碎条件：功率500W，能量80%，室温，开3秒停2秒，破碎时间30秒X秒（180秒）。10000 r/min ，4，离心20min，收集上层血红蛋白溶液（血红蛋白粗提液）。【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】1.3.3盐析沉淀取50ml血红蛋白粗提液制作盐析曲线，剩余部分（准确量体积）用于血红蛋白的盐析制备。（1）血红蛋白盐析曲线的制作（需要粗酶液4050 ml）a.取7支干净试管编号17，分别加入粗酶液5 ml； b.分别向15号试管中加入饱和硫酸铵1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，然后再分别加入蒸馏水4 ml、3 ml、2 ml 、1 ml、0 ml；分别向6号、7号试管中加先入固体硫酸铵0.66g和1.37g，再加饱和硫酸铵5 ml，充分摇晃溶解完全后，每管各取5ml2混匀的溶液装入7ml2离心管中，对应编号1、1/7、7/，静置1h以上，对称放入离心机中，10000 r/min ，离心10min，弃去上清液，收集沉淀。c.向收集的沉淀加入5 ml 0.1 mol/L（ pH7.0）磷酸缓冲溶液溶解沉淀物；d.采用Folin法测定各管中蛋白质的浓度，采用文齐氏液测定血红蛋白。e.以硫酸铵饱和度为横坐标，蛋白质浓度和血红蛋白的含量为纵坐标作图，得到蛋白质盐析曲线和血红蛋白盐析曲线。（2）盐析制备血红蛋白根据血红蛋白盐析曲线选择硫酸铵饱和度(40%饱和度)去除杂质，选择硫酸铵饱和度(60%饱和度)沉淀血红蛋白。并计算每升溶液达到40%饱和度和60%饱和度所需要的固体硫酸铵的量（g），根据血红蛋白粗提液的体积计算40%饱和度和60%饱和度时实际所需要的固体硫酸铵的量（g）。在血红蛋白粗提液中加入经研细的(NH4)2SO4粉末 ,使其达到40%饱和度,充分溶解后,4，10000r/min ,离心20 min ,除去沉淀。收集上清夜。继续向上清液中加入(NH4)2SO4粉末，使其达到 60 %饱和度 ,充分溶解后，4，10000 r/min ,离心 20 min ,弃去上清液，收集沉淀。-I将沉淀溶于少量蒸馏水中 ,加磷酸盐(K2HPO4 NaH2PO4 =1 1 ,1mol/1mol)达到 1 mol/L ,充分混均 ,4 放置约48 h后（可见血红蛋白粗结晶生成），4，10000 r/min，离心20 min ,将浮在上面的结晶收集 ,4 保存。-II将沉淀溶于少量0.1 mol/L（ pH7.0）磷酸缓冲溶液中,进一步纯化。【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】1.3.4 Sephadex G-75色谱纯化 选用15600800mm Sephadex G-75或Sephadex G-100色谱柱，加样量为 35mL （约含蛋白60100mg）用 20mmol/L （pH为7.0 ）的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度可控制为 0.5mL/min 即10min/管，可用 A280 的紫外线进行检测。如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，需要稀释后测量，测量方法如下：每管取 0.5mL 稀释 10 倍后用紫外线测量的结果。 以A280测量值为纵坐标，收集管号为横坐标绘制洗脱曲线，收集血红蛋白洗脱峰，取适当浓缩后进行蛋白质纯度的鉴定。剩余部分测量体积，置于冻干管中冷冻干燥（纯品血红蛋白）。【取5mL血红蛋白粗提液留作血红蛋白含量测定和纯度分析】1.4血红蛋白的纯度鉴定 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（试剂方法见生物化学原理和方法）2 结果与讨论1、蛋白质标准曲线2、血红蛋白盐析曲线3、Sephadex G-100柱层析图谱4、各步提纯结果（分离纯化进程结果比较表）纯化步骤总蛋白质mg血红蛋白mg相对纯度纯化倍数血红蛋白粗提液1.0硫酸铵沉淀血红蛋白粗结晶凝胶色谱5、聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。 3 结论研究表明: 1、2、3、4、 模 块I参考方案2：藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定藻蓝蛋白(phycocyanin , PC)是一种存在于蓝藻细胞内的光合色素 ,能高效捕获光能。其分子质量在 40 ku左右 ,由、两个亚基组成 ,亚基分子质量都在 20 ku 左右。肽链上共价结合 1 个开链的四吡咯环辅基 ,类似动物红细胞的血红素结构。天然存在的藻蓝蛋白通常以六聚体() 6的形式存在。与之相近的别藻蓝蛋白(Anthocyanin ,APC)为三聚体( ) 3 ,在 650 nm处有最大吸收峰。分离纯化的水溶藻蓝蛋白在溶液中呈蓝色 ,并发出紫色荧光 ,在波长620 nm具有特异吸收峰 ,可用吸光度 A620 / A280表示其纯度。因其水溶性、无毒、清亮且着色力强等优点 ,藻蓝蛋白被广泛用于食品着色剂和化妆品的添加剂。藻蓝蛋白带有荧光 ,可用作荧光标记物。一、教学目的通过藻蓝蛋白的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子制备方案设计与实践研究，体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法。整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64-80学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的动手机会。有利于培养学生的学习兴趣。二、实验方案1材料与方法1. 1 实验材料钝顶螺旋藻粉产自中国科学院武汉植物所 ,其他无机盐和酸碱试剂均为国产分析纯试剂。1. 2 分析方法1.2.1藻蓝蛋白浓度的测定方法一：【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】用紫外分光光度计对粗提的藻蓝蛋白溶液进行全波段扫描, 可见藻蓝蛋白的特征吸收在620nm, 异藻蓝蛋白的特征吸收在650nm处。提取液中藻蓝蛋白浓度(C)按公式(1)计算: ( 1)方法二：【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】螺旋藻中以藻胆蛋白吸收光谱的差异作为其测定标准。藻蓝蛋白( PC)在 620 nm处有最大光吸收,其含量测定参考王广策等人的相关研究方法: (1)【王广策, 周百成, 曾呈奎. 钝顶螺旋藻 c-藻蓝蛋白和多管藻R-藻红蛋白的分离及其摩尔消光系数的测定J .海洋科学1996 , 20 (1) : 52255.】1.2.2藻蓝蛋白的纯度测定【刘杨等，水提分离钝顶螺旋藻藻蓝蛋白及其稳定性研究，天津师范大学学报(自然科学版)，Vol.28 No.3.11-14（2008）】藻蓝蛋白的纯度为溶液在620和280 nm处吸光度的比值,而别藻蓝蛋白(APC) 最大光吸收在650 nm ,其含量的测定根据D. Kaplan等采用的方法: (2)式(1) - (2)中 , cPC和 cAPC分别代表藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的质量浓度(g/ L) ,A620和 A650分别代表波长在 620 和 650 nm处的吸光度。【Kaplan D , Calvert H E , Peters G A. The azolla-anabaena azollae relationship. : Nit rogenase activity and phycobiliproteins of the endophyte as a function of leaf age and cell typeJ . Plant Physiol , 1986 , 80 (4) : 8842890.】1.2.3 藻蓝蛋白提取得率的计算 【曲文娟等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的脉冲超声辅助提取技术，食品科学，2007年5期，135-138】藻蓝蛋白提取得率(T)为提取液中藻蓝蛋白的重量与原料重量的比值。按公式(2)计算: (3)式中: n样品稀释倍数;V提取液总体积, mL;G原料质量, mg。1.2.4 总蛋白质测定方法一：采用考马斯亮蓝法【李冰等，钝顶螺旋藻藻蓝蛋白提取纯化新工艺，海洋科学，2007 年，第31 卷，第8 期，48-52】取洁净干燥的试管分成两组按表1进行操作。标准蛋白质溶液质量浓度为500 mg/ L。表1 标准曲线制备（单位ul）试剂与操作1234567-样8-样标准蛋白质050100150200250-分析样品-250500蒸馏水5004504003503002502500将表各管加 3 mL 考马斯亮蓝 G -250 ,立即摇匀 ,置室温放置 15 min ,置于 595 nm波长处比色。以1-6号管标准蛋白质质量浓度(g/ L)为横坐标, 1-6号管A595 nm值为纵坐标作图,即得标准曲线。未知浓度的 1100倍稀释后按照7-样和8-样操作测定,根据 A595值推算出浓度大小。1. 3 藻蓝蛋白的提取分离 1. 3. 1 螺旋藻细胞的破碎和藻蓝蛋白粗提液的制备螺旋藻细胞悬浮液：准确称取 1.02.0 g 螺旋藻粉 ,加入 200 mL 的pH = 7. 0、 0. 01 mol/ L 的磷酸缓冲液, 4 分别浸泡 24h备用。细胞破碎：（选择冻融法或超声波法）方法一（冻融法）：取上述螺旋藻悬浮液在-20和30反复冻融(3次)使藻体细胞破碎,在显微镜下观察计数细胞破碎率在 90 %以上即可。方法二（超声波法）：取上述螺旋藻悬浮液进行超声波破碎，破碎条件：功率500W，能量80%，室温，开3秒停2秒，破碎时间2X分钟（5分钟）,在显微镜下观察计数细胞破碎率在 90 %以上即可。离心分离：将破碎的螺旋藻细胞悬浊液于 8000 r/ min 离心 15 min ,收集上清液可得到含藻蛋白的粗提液。在 568、620和650 nm处测粗提液的吸光度,计算藻蓝蛋白的含量。1. 3. 2 沉淀分离藻蓝蛋白1.3.2.1盐析法沉淀藻蓝蛋白（1）藻蓝蛋白盐析曲线的制作（需要藻蓝蛋白粗提液4050 ml，选做）a.取6支干净试管编号16，分别加入粗提液5 ml； b.分别向14号试管中加入饱和硫酸铵2 ml、3 ml、4 ml、5 ml，然后再分别加入蒸馏水3 ml、2 ml 、1 ml、0 ml；向5号、6号试管中分别先加入固体硫酸铵0.66g和1.37g，再加饱和硫酸铵5 ml，充分摇晃溶解完全后，硫酸铵饱和度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%，每管各取5ml2混匀的溶液装入7ml2离心管中，对应编号1-16-6，室温（或0）静置4h以上，对称放入离心机中，10 000 r/min ，离心10min，弃去上清液，收集沉淀。c.向收集的沉淀加入5 ml 0.1 mol/L（pH7.0）磷酸缓冲溶液溶解沉淀物；d.测定各管中总蛋白质的浓度、藻蓝蛋白浓度和纯度。e.以硫酸铵饱和度为横坐标，总蛋白质浓度和藻蓝蛋白的含量为纵坐标作图，得到蛋白质盐析曲线和藻蓝蛋白盐析曲线。（2）藻蓝蛋白盐析沉淀分离在装有固定体积藻蓝蛋白粗提液的烧杯中加入一定量的(NH4)2SO4 粉末（使其达到20%饱和度）,边加边搅拌 ,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性 ,室温（或0）静置4h以上，使藻蓝蛋白粗提液中的杂质沉淀, 以8 00010 000 r/ min离心 20 min ;收集上清液，继续添加(NH4)2SO4 粉末使其达到50%饱和度,室温（或0）静置4h以上，使藻蓝蛋白盐析沉淀,再于冷冻（- 4）离心机中以8 00010 000 r/ min离心20 min ,收集沉淀。将上述离心得到的沉淀用 1/ 4 上清液体积的0.1 mol/L(pH=7. 0)磷酸缓冲液溶解,并倾倒于透析袋中 ,再置于去离子水中透析 24 h (每隔4 h 更换一次去离子水) ; 透析结束后 ,再于冷冻（- 4）离心机中，以8 00010 000 r/ min离心 20 min ;收集上清液，取一定量用于在280、620 和650 nm下测吸光度 ,计算藻蓝蛋白的含量，其余部分可继续采用离子交换柱层析进一步纯化，也可直接冷冻干燥得到藻蓝蛋白粗制品。将上述离心得到的沉淀用 1/ 4 上清液体积的0.1 mol/L(pH=7. 0)磷酸缓冲液溶解, 再于冷冻（- 4）离心机中，以8 00010 000 r/ min离心 20 min ;收集上清液，取一定量用于在280、620 和650 nm下测吸光度 ,计算藻蓝蛋白的含量，其余部分可继续采用Sephadex G-200柱层析进一步纯化。1. 3. 2.2 等电点法沉淀藻蓝蛋白（选做）在装有固定体积藻蛋白粗提液的烧杯中加入0.1 mol/ L稀H2SO4溶液 ,边加边搅拌 ,以防溶液局部过浓使蛋白质发生变性 ,将藻蛋白粗提液 pH调节为4.0,即藻蓝蛋白的等电点附近 ,静置过夜 ,于冷冻（- 4）离心机中，以10 000 r/ min 离心20 min ;将离心得到的沉淀用 1/ 4 上清液体积的0.1 mol/L(pH=7. 0)磷酸缓冲液充分溶解 ,再于冷冻（- 4）高速离心机中以10 000 r/ min离心20 min ;取上清液,在 280、620和650 nm下测吸光度 ,计算藻蓝蛋白的含量。1. 3. 4 Sephadex G-200色谱纯化 选用15600800mm Sephadex G-200色谱柱，加样量为 35mL （约含蛋白60100mg）用 20mmol/L （pH为7.0 ）的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度可控制为 0.5mL/min 即10min/管，可用 A280 的紫外线进行检测。如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，需要稀释后测量，测量方法如