CTAB—硅珠法提取DNA实验流程.doc

CTAB硅珠法提取DNA实验流程前言:实验是要求非常严谨的过程,每个一步骤都可能对后面的操作产生很大影响,乃至影响后面的结果.一步错,步步错,每一个操作的失误都可能导致整个实验的失败.事实求是与踏踏实实的作风是每个做实验的人必备的基本品质.永远记住,任何弄虚作假的行为都是可耻的.在这个充满学术腐败的科学界,保持自己的纯真. 谨记1.材料的采集采取植物的嫩叶,可以用硅胶干燥保存,也可以用冰袋,主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化.用泡沫塑料箱子带回,置于-70冰箱保存.2.CTAB硅珠法提取DNA实验流程各加入液体的配制：1、CTAB提取液：2%（W/V g/mol ）CTAB；5%（W/V g/mol）PVP； 1.4mol/lNaCl；20mmol/L EDTA PH=8.0； l00mmol/l Tris-HCl PH=8.0； 2%(V/V)巯基乙醇(临时加入)配制量：500ml配制方法：(1)计算所需组分量CTAB 10g 需热磁力搅拌PVP 25g NaCl 40.908g EDTA.Na2.2H2O 3.7224g 调PH=8 冷却为常温时(母液)Tris 6.057g (2)称取CTAB 10 g， NaCl 40.908g， PVP 25g置于500ml烧杯中(3)加入约300dd H2O(双蒸水)充分磁力搅拌溶解(注意：EDTA和PVP较难溶，加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止)(4)量取20mlEDTA(0.5mol/l PH=8 )， 50ml Tris-HCl(1 mol/l PH=8)溶液于烧杯中，均匀混合(5)将烧杯溶液定容至500ml后，高温高压灭菌(6)室温保存。0.5mol/LEDTA 配制组分浓度： 0.5mol/l EDTA， PH=8配制量：500ml配制方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O，置于500 ml烧杯中 (2)加入约400ml dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌 (3)用NaOH调节PH值到8，约用10克固体NaOH (4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至PH=8 (5)加dd H2O将溶液定容到500 ml (6)高温高压灭菌后，室温保存NaOH溶液的配制组分浓度：5 mol/l NaOH配制量：100 ml配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中(2)加入dd H2O定容到100 ml100 mmol/l Tris-HCl的配制组分浓度： mmol/l Tris-HCl， PH=6.4配制量：250 ml配制方法(1)称取3.025克Tris于250 ml烧杯中. (2)加入约200ml dd H2O充分搅拌溶解. (3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3 ml (4)将溶液定容至250ml (5)用棕色瓶分装于4度冰箱中 (6)如使用，用水浴加热溶解.2、氯仿-异戊醇的配制：配制方法(1)简单的体积混合，既要求比例为24：1即可 (2)储存于棕色玻璃瓶子中 (3)置于4度冰箱以便日后使用3总的实验流程3.1总的DNA的提取：1. 在10ml离心管（eppendorf管）中加入4mlCTAB提取液及80ul巯基乙醇，在65水浴锅中预热2. 取材料1-2g于研钵中，加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状，转至预热的CTAB提取液中，用封口膜将离心管封密以防止巯基乙醇挥发.放回水浴中保温30分钟，保温过程中轻晃几次，保持摇匀.3. 取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷却到室温，加入等体积的4ml氯仿-异戊醇（24：1），轻微混合均匀且充分，使其彻底地混合成乳状液，然后4下离心12000rpm 10min，轻轻将上清液吸取1ml于1.5ml离心管，放于-20冰箱中备用.各加入液的用途：（1）去污剂：CTAB：可将细胞膜裂解，使DNA释放到提取液中，同时也使组织匀浆中的蛋白质变性.EDTA：能与DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，不能降解从细胞中释放的DNA.（2）还原剂巯基乙醇：它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.（3）氯仿异戊醇：它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将DNA与细胞中的蛋白质、碳水化合物等分开除去.（4）RNase：它可去除核酸中的RNA，只留下DNA.3.2总DNA的纯化操作步骤：1. 取出1.5ml离心管，内含所取DNA，加入100ul硅珠悬浮液（此液要求先行涡旋再使用），使用涡旋振荡器大约15s，使之充分混匀，于室温静置10分钟，再振荡5秒，后离心：8000rpm 15s 4度，去除上清液得到硅珠核酸复合物.2. 将复合物用镊子一次打两个，打成液状，使之完全分散，加入漂洗液1ml，再涡旋充分混匀，后离心8000rpm 15s 弃掉上清液.3. 重复上一步一次.4. 用70%的1ml乙醇将硅珠核酸复合物漂洗两次.每次涡旋充分混匀后，离心8000rpm 15s，弃上清液，打散，最后用1ml无水乙醇再漂洗一次，用涡旋混匀离心8000rpm 15s，然后将离心管管口打开倒置在吸水纸上，再将沉淀置于真空冷冻干燥机中风干复合物10分钟.5. 加入100ulTE缓冲液充分混匀后，于56度水浴中保温10分钟，然后离心12000rpm 5min.取上清液即为所需的DNA.6. 将余下的复合物再次完全打散（即涡旋），加入100ulTE缓冲液进行第二次重旋，并于56度水浴中保温10min， 12000rpm 5min，取上清液于步骤5管中共存.7. 将两次二合一的上清液离心混匀14000rpm 10min ，取上清液存于-20冰箱中.仪器的使用真空干燥器： 在使用前要求先预热30分钟，只打开1号阀门. 打开盖子平衡放入离心管，然后顺次开启2号3号4号5号门.进行干燥处理5分钟. 关闭各阀门.顺序为5号4号3号2号1号阀门.各加入液的配制1、硅珠悬浮液的配制（1） 称取1.2g硅珠粉，溶解于10ml无菌水中.（2） 放入4冰箱备用.（3） 使用时先涡旋使其混合均匀.2、漂洗液的配制称取GuSCN（可能产生有毒气体，要求在通风橱中进行）120克溶解于100mlTris-HCl(100mM PH6.4)中.要求在60水浴中溶解.3、TE缓冲液的配制10TE，500ml配制如下：将100mM Tris-Hcl（PH=8.0）6.057g与10mM EDTA（PH=8.0）1.8612g溶于400ddH2O中，调PH=8.0，定容到500ml。3.3.DNA样品浓度、纯度测定取4ul DNA水溶液用双蒸水稀释到400ul，用紫外分光光度计测定其D23Onm、D260nm、D280nm值.根据D260nm值估测浓度。根据D260nm/D23Onm、D260nm/D280nm值估测其纯度.（1）浓度计算公式：对于双链DNA而言D260nm为50ug/ml DNA样品的浓度（ug/ml）= D260nm稀释倍数50/1000（2） 纯度估测标准：纯的DNA溶液其D260nm/D280nm=1.8；D260nm/D23Onm 2.0DNA浓度的精确测定： 去除一定量的DNA，稀释成200ug/ul，配制少量400、200、100和50 ng 的DNA.取标准DNA和样品各1ul，进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳.紫外灯下比较样品DNA条带的亮度，并对DNA样品进行定量、调整样品的DNA的量与100ugDNA的亮度相一致.总的DNA 跑出来条带在紫外光下看应该是明亮的一条,没有拖尾的现象,若有的话可能DNA部分降解或提纯的不彻底,含有的RNA较多.虽然SSR对模板的要求不是太严格,具体能否扩出条带,还须实验证明,或重新提取.2.PCR扩增SSR-PCR扩增反应体系1、10ul反应体系：调温高压灭菌水H2O 5.45ul 5.45ula 5.45ulab10Buffer 1ul 1ula 1ulab2mM-dNTP 1ul 1ula 1ulab25mu-MgCl2 1ul 1ula 1ulabr-Taq 0.05ul 0.05ua l 0.05ulabPrimer+ 0.25ul 0.25ula 0.25ulabPrimer- 0.25ul 0.25ula 0.25ulabDNA模板 1ul 说明：a个反应量=不同模板n+2，b为引物数+22、作程序及其注意事项：1) 分装各型枪头.2) 分装各型离心管.3) 顺次用碳笔标明引物号，小master顺序号及总master顺序号.、4) 收取冰块半盘，将取出各液放于冰上.5) 配总master，先计算好ab6) d-NTP和MgCl2要求加样前先轻微涡旋混匀， Taq酶要求在冰箱口取用.7) 配master的顺序：H2OBuffer-dNTP-MgCl2-Taq8) 轻涡旋总Master9) 分装C个引物个小Master10) 向C个小Master加入C个引物11) 将含引物的C个Master涡旋混匀12) 将N个模版点加到NC个小离心管中，各含1ulDNA13) 将各小Master，每9ul加入到含1ulDNA的离心管中14) 时刻注意更换枪头，防止交叉感染，尽量不要将枪头放在液面下.15) 将扩增好的DNA进行溴酚蓝点样，每离心管8ul3、各加入液的配制（1） 引物的稀释1) 每管引物先1000rpm 3min进行离心，将附在管壁上的粉末或膜状物离心到底部，小心打开盖子.2) 加入经高温高压的灭菌水.针对不同的引物加入不同的量3) 使最终浓度都为10um/L（2） 溴酚蓝的配制1) 将0.125克溴酚蓝，20克蔗糖溶解为50ml的ddH2O2) 再进行过滤3) 放于4冰箱中储存（3） Buffer的配制1）1TE Buffer组成浓度：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0配制量：500ml配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中 1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml 0.5M EDTA PH=8.0 1ml 向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.2）10TE Buffer组成浓度：100mM Tris-HCl 10mM EDTA PH=8.0配制量：1000ml配制方法：量取下列溶液于1升烧杯中：1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 100ml；0.5M EDTA PH=8.0 20ml向烧杯中加入约800mldd H2O均匀混合；将溶液定容到1升后，高温高压灭菌；室温保存.1MTris-HCl 的配制：组分浓度：1M PH=7.4 7.6 8.0配制量：500ml配制方法：称取6.057克Tris置于500ml烧杯中；加入约400ml的 dd H2O充分搅拌溶解；按下表量加入浓盐酸调节所需PH值PH值 浓盐酸量7.4 35ml7.6 30ml8.0 21ml 将溶液定容到500ml；高温高压灭菌后，室温保存.PCR反应体系1、本实验样品所采用的反应程序：2、PCR扩增仪的操作：1）先通过观察哪个指示灯是空的扩增仪2）右旋打开盖子，按顺序摆放并用手柄轮压实3）做旋盖好盖子至刻度处4）打开操作程序，选好人名反应体系并逐一确定5）掌握扩增仪时间2:30降温需30分钟聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGEPAGE操作流程及注意事项：1、涂胶1） 将有耳玻片（耳朝下）泡于反硅化剂中，新液25分钟，旧液30分钟.2） 涂无耳正面玻片硅化剂.均匀点四滴，轻而匀的沿一个方向涂三次，静10分钟.3） 到时间取出.打开通风橱风干30分钟.2、封胶1） 将两玻片对贴于橡胶框中，放平，用力拧死，夹住橡胶管.2） 溶废琼脂胶，分两次：第一次50秒，第二次10-20秒，防止沸出.3） 用小细长枪头通透加胶枪头，便于加样通畅，少起气泡.4） 吸2500-3000ul液胶加速沿玻片边缘快速顺下滴，将两面玻片充分封死，防止漏胶.以水平底线面水平高于底为佳，静止凝胶15分钟.（有时可先在封口加一点TBE以润滑玻片，利于胶流下）3、灌胶1) 用长细枪头透开加胶枪头2) 从中间加入，每次不要全部打完，留一点在枪头内.防止断流而导致胶中含有气泡.3) 插梳子时两端平整，梳子紧贴玻板，梳齿头部不可有气泡.4) 拔梳子时先加一倍TBE液将梳子泡透，然后平行用力拔出.5) 在插梳子15分钟内跟踪观察，适当下按，保证孔的深度.6) 等待2小时，以便胶充分凝固.4、吹孔1） 向中间槽加入1倍粗制TBE，要淹没过内玻片约1厘米.2） 拔梳子，小心平稳，均匀平衡.3） 调1000p枪到300-600ul，进行吹孔，将小孔内沉淀物吹打干净，加样中再视时吹孔.5、加样1） 用细长专用枪加入DNA 0.5ul.2） 一手托另一臂的肘，以保证加样手不抖.3） 一定垂直加到孔中去，不脱尾，不吸水，不靠壁，干净利落.4） 加完一次.在放于桌旁的吸纸上，将细枪头上余液吸干.5） 首、中、尾各留1到2个孔，两面胶孔的Marker不完全一样，以便区分.6） 加Marker 0.15ul 一般取0.3ul每孔注如一半，可用两个孔.6、跑胶1) 向两侧槽中加入粗制TBE，至U管线处.2) 打开电源，稳压到120V3) 电泳2h左右4) 当样品跑到底部2cm处，关闭电源.7、撬玻片1） 刀片不伸入过深.刀片平行于玻片，稍用力.2） 将没有硅化剂的无耳玻片放于水盘中，还有梳子.3） 清理琼脂胶，放于烧杯中.4） 胶玻片放于盘中，银染.各加入液的配制1、反硅化剂的配制1） 量取500ml ddH2O.2） 用冰乙酸把ddH2O PH调至3.5.3） 再加Bind-silica 2ml.4） 用热磁力搅拌器搅拌均匀.2、TBE电泳母液（10）的配制1） 分别称取54克Tris碱，27.5克硼酸，20ml 0.5mol/EDTA（PH=8.0）2） 将各组分别加入1升烧杯中，用ddH2O定容到1升.3） 在电泳时使用1倍工作液，按1：4与水混合.4） 1倍液是为了增加电泳工作液的电流的电流量.5） 盛于玻璃瓶，在室温保存.3、聚丙烯酰胺的配