新生儿葡萄糖6-磷酸脱氢酶 2007.10.doc

产品说明书新生儿葡萄糖6-磷酸脱氢酶（Neonatal G6PD）试剂盒使用说明书修订日期：2007.10产品编号：ND-1000【用途】本试剂盒用于定量测定采血滤纸片上血标本中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的浓度，以辅助筛查新生儿G6PD缺乏症。【测试简介和说明】葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是一种临床上最常见的酶缺乏症。它是一种等位基因异常现象，以X染色体连锁的隐性形式遗传下来。全世界约有2-4亿人患有G6PD缺乏症。本质上说，它是一种异质情况，并以男性居多，因为男性只有一条G6PD拷贝，因此他们要么正常，要么异常。女性可以为正常、杂合体或纯合体，仅依靠表型很难区分。患有G6PD缺乏症的女性杂合体病人有一条正常G6PD合成的基因拷贝，和另一条产生变体酶的基因拷贝。正是由于这种双向合成使女性杂合体病人有两种红细胞群体，一种正常，一种则缺乏G6PD。这就使杂合体女性的G6PD缺乏症很难得以诊断，因为正常红细胞部分地掩盖了异常红细胞。这种掩盖发生时，女性G6PD缺乏症病人一般会产生比男性病人高的定量结果。根据G6PD变体的轻重程度，可将其分为四种：第一种是遗传性非球形红细胞溶血性贫血；第二种是G6PD严重缺乏症；第三种是G6PD轻度缺乏症；第四种是缺乏性变体。G6PD缺乏症在美国的发生率为0.6-2.9%；中东高达26%；在台湾，男性发病率为4.5%，女性为2.7%。G6PD缺乏症患者对一些化学物质敏感，如抗疟疾药、6-氨基喹啉、蚕豆、磺胺类药物、一些感染、大剂量维生素C都能引起溶血作用。因接触沉淀因子而致氧化应激的患者常表现为黄疸、疲劳、面色苍白、呼吸急促、嗜睡、心动过速和脾肿大。对G6PD缺乏症的处理方法是避免接触沉淀因子。新生儿和幼儿患G6PD缺乏症尤其值得关注，因为未结合胆红素积累到一定程度时会导致脑核黄疸症，这种病是导致新生儿智力迟钝和死亡的主要原因。第二种G6PD变体水平较高的新生儿的黄疸发生率明显高于其他群体，但是，一旦发现，可通过光线疗法和苯巴比妥鲁米治疗进行预防。【测试原理】几乎所有的哺乳动物细胞中都有G6PD，只是含量不同，它催化己糖单磷酸途径的第一阶段。测试中，通过血点样本中的G6PD和伴随的NADP还原为NADPH的过程，葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）底物氧化成6-磷酸葡萄糖（6-PG）。在室温下使血点样本和含有G-6-P及NADP的底物试剂反应30分钟。可加入硫酸铜使反应速度减慢。使用激发波长355nm和发射波长460nm，进行荧光强度测量。下面是G6PD测试的反应过程概述，其中箭头上方的酶在血点样本中；G-6-P及NADP+在底物试剂中；其他物质均为反应生成物。G6PDG-6-P + NADP+ 6-PG + NADPH* + H+ （* 荧光素）【试剂盒成分】每一个新生儿G6PD试剂盒含960人份试剂。试剂盒的有效期贴在外包装上，在+2 - +8C条件下保存。成分数量保质期和储存条件G6PD calibrators（G6PD定标品）（近似值）A 0.2 U/g HbB 1.7 U/g HbC 3.0 U/g HbD 5.0 U/g HbE 6.6 U/g HbF 7.8 U/g Hb1张滤纸卡（Whatman,903号）含5套干血点冷藏保存，在原包装内防潮避光。+2+8C条件下可保存到标签所示的失效期。确保储存期间塑料袋密封完好。精确的G6PD浓度请参考试剂盒中相应批号的质量控制证书。G6PD controls（G6PD质控品）（近似值）正常 5.5 U/g Hb异常 1 U/g Hb1张滤纸卡（Whatman,903号）含5套干血点放在冰箱内，在原包装内保存，防潮避光。+2+8C条件下可保存到瓶上标签所示的失效期。质控品的靶值请参考试剂盒中相应批号的质量控制证书。G6PD Substrate Reagent（G6PD底物试剂）10小瓶，冻干 +2+8C条件下保存到瓶上标签所示的失效期。试剂含有-烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP），葡萄糖-6-磷酸和蔗糖。G6PD Reconstitution Buffer（G6PD 复溶缓冲液）1瓶，118mL +2+8C条件下保存到瓶上标签所示的失效期。备用的缓冲液含Tris-HCl、氯化镁，用ProClin 300作防腐剂。铜试剂（Copper Reagent）1瓶，240mL +2+8C条件下保存到瓶上标签所示的失效期。备用试剂含碳酸钠、酒石酸钠钾和0.05%的硫酸铜。White microplates（白色微孔板）（未包被，96孔）10板+2+25CBarcode labels for the plate（微孔板条形码标签）30份 注意：条形码随批号改变。Lot specific quality control certificate（和试剂盒批号匹配的质量控制证书）1份【试剂盒没有提供的其他必需品】新生儿G6PD试剂盒是由新生儿筛查试剂和仪器组成的完整系统的一部分。本系统需要的以下材料可以从PerkinElmer Life and Analytical Sciences公司或其代理商处购得。1. VictorTM2D荧光计1420-020型（无栈架）或1420-021型（带栈架）、打印机和电脑2. 自动打孔器-Wallac DBS Puncher（产品号1296-071）或Wallac MultiPuncherTM3（产品号1296-081），或手动打孔器，用来切割直径3.2mm（1/8 inch）的滤纸盘。3. 自动振荡器-DELFIA Plateshake（产品号1296-003/004）除了需要DELFIA系统，还需要以下材料：8通道精确移液器，用于30-300uL容量移液或Apricot Sample Processor样品处理器（MS-550XD）移液吸头振荡器/混合器，用于混合G6PD底物试剂用于测量mL容量试剂的移液器或带刻度量筒试剂库用FDA批准的滤纸制成的标本卡【标本的采集和处理】由于本测试测量的是G6PD的酶活性，而不是代谢产物，因此可在婴儿出生后的任意时间内采血。血样应直接从足跟采集到滤纸片上。胆红素685umol/L和血红蛋白250g/L不影响测试。如果标本不直接采集到滤纸上（没选此方法），请勿使用含有EDTA或柠檬酸盐的管或毛细管采血，因为这些抗凝剂会和铕标发生鳌合作用而影响测试。新生儿筛查程序有别于其他需要采集标本的程序。在美国，推荐的采血点是直径约为12.7mm（1/2英寸），用足跟采血法并点到滤纸片上。通常是在出生后2-6天内进行足跟采血。但是在其他一些筛查程序中，采样时间和数量可能不同。采样时间和筛查标本的采集应符合当地相关规定。样本采样所用的器械必须符合FDA的规定。FDA通过的滤纸中，血清吸收性和hTSH回收性随滤纸批号变化。但这不会引起总量化错误。干全血标本的采集方法需要熟练的标本收集、处理和运输技术。血标本收集技术见NCCLS文件LA4-A4。此方法要点为：酒精棉签清洗局部皮肤后，风干。用消毒后的采血刀（或自动采血刀装置）刺入婴儿足跟部，入皮深度以1.0-2.0mm为宜。深过2.0mm易造成婴儿的骨损伤。擦去最初流出的第一滴血，轻轻将滤纸贴附于随后流出的大滴血上，使得足量的血浸透浸满滤纸上预先已经印好的圆圈。此步骤应一次完成。检查滤纸的两面，确保血液已经渗透全层滤纸。挤压创口有可能导致标本发生溶血及组织液混入血标本内。勿将随后渗出的血滴继续滴到滤纸收集环上（这样导致样品堆积成块）。血标本水平放置于室温下（+15+22C），至少3小时使之风干。避免直接光照。在干燥过程中不要加热标本或把标本叠放在一起。务必填充样品采集卡上所要求填写的信息。预先打印好的信息至少包括：姓氏（名字，如有），性别、出生日期（可选：出生时间），出生时重量，幼儿年龄（出生时不足24小时的请注明）和病人身份号码。母亲姓名标本采集日期（可选：采集时间）提交人姓名和地址（可选：助产设施）医生姓名和电话号码（保健提供者）新生儿筛查项目名称和地址每份卡都应有单独的系列号和有效期在将标本装入容器运输之前，应该用物理屏障将采集卡上的干全血点与其上下层采血卡上的血点分开或旋转180度。也可以用一块可折叠封盖或玻璃纸隔开样品来保护干血点。遵守当地关于包装和运输样品的邮寄和运输规定。标本不应放在密封的容器内（例如塑料或带箔片的袋子内）。如果必须如此，一定要在袋中放入干燥剂。湿度和潮气对干血标本不利。采集后24小时内运输或邮寄到实验室，或遵照筛查实验室的具体规定。有些筛查实验室可能会要求在采集卡上填写其他信息，如婴儿是否早产或超过预产日期出生，如果事实如此，则需提供早产和迟产日期，是否是孪生，有关喂养、可能的抗生素以及是否接受输血等信息。请咨询当地的法规和机构的政策，以了解样本采集仪器所需要的最少信息。在可能的情况下，应将标本在+2+8C条件下保存。室温下保存的血点标本，其G6PD的活性可能会大幅下降。标本到达后应立即进行测试。失去G6PD活性的标本可能产生假阳性测试结果。注意：如果在标本采集后3-4周或更长时间才进行分析，血片很可能会在板孔中的溶液里漂浮起来。这种情况下的具体操作方法，请参见“操作注意事项”。【测试步骤】定标品和质控品都要进行复孔测定。每块微孔板都应作定标曲线。未知样品可进行单次测定。使用前所有试剂和样本必须恢复至室温（+20+25C）。这一点对铜试剂尤为重要，因其在低温时产生沉淀物。1、试剂准备复溶后的稳定性G6PD底物试剂 +2+8C条件下稳定7天。在每个冻干的G6PD底物试剂小瓶中加入11mL的G6PD复溶缓冲液（配制后的溶液为1个微孔板用量），轻轻混匀。注意：应该在使用前至少5分钟复溶G6PD底物试剂。2、使用自动或手动打孔器将滤纸盘打入板孔，并把打下的血点放在白色微孔板的板孔内。纸盘的直径约为3.2mm（1/8英寸）。每块微孔板上都要有定标品和质控品，均为复孔。每个实验室可以自行决定质控品和样品的最佳排列位置。3、向每个装有滤纸片的板孔中加入100L复溶G6PD底物试剂。不要让移液器接触到微孔板上的内容物。4、室温下孵育30分钟，用DELFIA Plateshake振荡器慢速振荡。不要覆盖或叠放微孔板。5、如果需要，振荡铜试剂瓶，向试剂库中倒入21mL/板孔。应测量准确，防止浪费。在每个板孔中加入200L。轻轻敲拍微孔板使孔内溶液混匀。加入铜试剂后（15分钟）要马上读取。6、在VICTORTMD荧光计内测量荧光强度。在Start Wizard中开始测量，从Protocols/Kits面板“Neonatal USA”中选择“94G6PDS”并定义微孔板和样品数。检查MultiCalc4操作步骤“94G6PDS”。如果改变了样品的复制数，也要相应地改变操作步骤（编辑参数见荧光计操作手册或MultiCalc操作手册）。【操作注意事项】1、 应充分理解本说明书以便顺利使用本新生儿试剂盒。试剂盒内的试剂作为一个整体使用。请不要将不同批号的试剂混用。不要使用过期的试剂。2、 任何与测试相违背的操作都可能影响测试结果。3、 荧光数值可能随时间波动，但可以在每个微孔板中使用定标品以保持计算浓度稳定。4、 漂浮的血点会产生假阳性结果。有漂浮血点的板孔的结果比板孔底部的血点结果低大约1-4 U/g Hb。加入铜试剂并敲拍微孔板，可以将漂浮的血点推到板孔底部（使用干净的移液吸头或类似物品压沉血点）。因老化，加热或冻融而变性的血片可能不能进行正常的浸润或洗提，这些血片会漂浮起来并且在被推到板孔底部后仍会漂浮起来，这时该血片需废弃，换新鲜标本进行测定。血片推到微孔底部后不再漂浮起来，则测定结果有效。5、 使用前所有试剂和样品应达到室温。6、 所有步骤都要使用反向移液。一般来讲，反向移液用于少量移液时更为精确。7、 打孔后，确认每个板孔中都有滤纸。【结果计算】本系统整合了完整的数据计算程序，可以通过打印输出标准曲线和样品浓度等获得结果（详细信息请参考荧光测量计手册或MultiCalc手册）。定标：每个微孔板都应作完整的标准曲线。由MultiCalc计算得出的定标曲线的相关系数（r）应0.975。【预期值与结果说明】根据预确定的临界值来确定G6PD缺乏症的推测阳性结果，但这一测试不适用于筛查G6PD缺乏症女性杂合体患者。从遗传的角度看，G6PD缺乏症的发病率在一些人群中要比其他人群高。请注意，此处提到的数值只作为参考，每个实验室都应该建立自己的参考值范围和临界值。确定临界值的研究是在菲律宾和中国分别进行的。在两个国家中，选定样品的检测方法是PerkinElmer G6PD试剂盒和实验室当前使用的试验方法。将PerkinElmer方法与Boehringer-Mannheim（菲律宾）和HICN（中国）方法进行比较并使用它们作为标准时，假定对结果的解释是正确的。从“确定性试验”的意义上说，Boehringer-Mannheim和HICN方法并非真正的“正确比较”。临界点是在将假阳性和假阴性结果最小化的基础上确定的。每项研究得出的临界值都稍有不同。由于下面所列的研究中得出的临界值是以比较每个实验室目前的方法为基础的，那些没有适合的方法的实验室应该由使用2.6 U/g Hb的临界值开始。在检测至少1000例样品之后应该对临界值进行再评估，并与下面分布曲线中展示的数据进行比较。来自中国的试验性结果：PerkinElmer G6PD测试