SHED培养.doc

SHED培养基本试剂、仪器高糖型DMEM 培养基胎牛血清型胶原酶dispase 酶胰酶1：250抗波形蛋白多克隆抗体（Vimentin）高倍双抗液不完全培养液完全培养液磷酸盐缓冲液 鼠抗人波形蛋白多克隆抗体鼠抗人STRO-1多克隆抗体鼠抗人CD44多克隆抗体即用型SABC 免疫组化染色试剂盒培养皿，培养瓶70m 细胞筛网倒置相差显微镜及照相系统CO2 培养箱圆筒式过滤器血细胞计数板电热恒温水槽低温高速离心机SHED培养基本步骤1. 经患者及家属同意后，收集610岁儿童临床上因滞留而拔除的乳切牙，要求没有牙体牙髓病变。拔除后立即置入4C 预冷的装有少量不完全培养基的试管中备用，在24 小时内取出使用。2. 从预冷的培养液中取出牙齿,高倍双抗液反复冲洗,无菌条件下沿牙齿长轴劈开牙冠,取出冠根部牙髓,无菌PBS 反复冲洗，切除根尖部1的牙髓组织。剪碎牙髓组织,置于无菌小锥形瓶中。3. 3mg/ml collagenase type、4mg/ml dispase按1：1混合，牙髓碎片放入混合液中，37水浴，消化15min。4. 待组织块呈絮状加入完全生长液终止消化，300g离心力离心5 min，弃去上清液。5. 将组织团块均匀铺入35 cm的培养皿中，在各组织块处分别滴加501 00 UL完全生长液，置入37、体积分数5C02培养箱中孵育，两三天更换完全生长液。6. 待组织周边有较多的细胞爬出后，挑弃组织块，补足完全生长液继续孵育。7. 当大多数克隆的细胞汇合至80一90时，吸弃原来的培养液，加入0.25%胰酶溶液，使细胞充分浸润，一般消化时间1-3min,肉眼观察瓶底由半透明转为点状透明时弃去胰液，并加入适量有血清培养液终止消化，吹打分散、传代。有限稀释法纯化SHED1 取对数生长期的第一代乳牙牙髓细胞，用含20% 胎牛血清的高糖DMEM 培养基倍比稀释，调整细胞密度至1015 个/mL，充分吹打混匀。2 按100L/孔接种于96 孔板中，培养24h 后标记单个细胞孔，并补液至200L/孔，4d 换液。3. 当细胞数量增多时每23d 换液，待长满孔底后0.25%胰蛋白酶消化，扩大培养。磁珠分离筛选SHED1. 取生长状态良好的第3代乳牙牙髓细胞1108以含1%胎牛血清的PBS重悬，加STRO-1抗体，4孵育60min,每隔10min轻振防止细胞沉淀。2. 用含有0.1%胎牛血清的PBS清洗三次，去除残留抗体。3. 细胞再次重悬通过30m的滤网获得单细胞悬液，按说明加入相应剂量的磁珠混匀，4孵育1 5min，加人10ml缓冲被以300 g离心力离心10min，完全去除上清。4. 加入500m缓冲液混匀细胞团。5. 将分选柱置磁力架上用500m缓冲液预先润湿分选柱，缓冲液快要滴完时将细胞悬液加选到分选柱内不要产生气泡，待细胞悬液快要滴完时加人500m缓冲液重复3次，收集从分选柱流出的SHED。6. 从分选器上取下分选柱加入1ml缓冲液，用分选柱配套的推子快速推下，将收集到的SHED再次经过分选柱重复筛选一次。7. 加入含15%胎牛血清的完全培养液4ml置37、5%C02培养箱中培养。SHED的鉴定1. 细胞克隆形成率（CFU）的测定A. 取纯化的第2 代人乳牙牙髓干细胞以1105个/孔的密度接种6 孔板,加培养液2.5mL，标准条件下培养约14。B镜下观察培养皿中出现细胞克隆,终止培养,加纯甲醇固定15min,适量姬姆萨染液染色15min,流水缓慢冲净,空气干燥。C. 显微镜下进行细胞克隆计数(50 个细胞为1 个细胞克隆).克隆形成率=形成细胞集落数/接种细胞数(1105)。2. 免疫组化染色A. 将纯化的第2代细胞以3104/mL接种于预置小盖玻片的24孔培养板中，置37C、5% CO2温箱中培养2d.B. 细胞铺满后，取出小盖玻片置于PBS漂洗三次，每次5分钟。C. 放入预冷的95%丙酮20分钟，取出后PBS漂洗三次，每次5分钟。D. 浸入0.75%H2O2-PBS（30%H2O25ml+PBS200ml），于室温放置20分钟，以去除内源性过氧化物酶。PBS漂洗三次，每次5分钟。E. 滴加正常马血清（10%血清-PBS），置湿盒内于37C暖箱内30分钟。F. 弃去正常马血清。抗波形蛋白多克隆抗体免疫组化染色抗STRO-1多克隆抗体免疫组化染色免疫荧光染色。G. 空白对照组加PBS代替一抗。3. 流式细胞仪分选细胞A. 收集磁珠分选后状态良好的细胞，消化后制备成细胞密度为1106/ml的细胞悬液。B. 分别以荧光索标记的抗CD29mAbPE，抗CD34mAb-PE，抗CD45mAb-FITC，抗CDl05mAb-FITC细胞行单色荧光染色(避光)，用流式细胞术进行检测并以骨髓间质干细胞的相应标记表达为阳性对照。4. 多向诱导分化实验A. 矿化诱导：将筛选培养的SHED制成细胞悬液，以台20胎牛血清的-MEM培养常规换液。取SHED制成细胞悬液以2xlO4/ml的密度接种到玻片上。当细胞融合至80后换矿化诱导液(100m/ml链霉素、100U/ml青霉素、10mmol/L -甘油磷酸钠、50g/ml维生素C、110-8mol/L地塞米松、10ml/L胎牛血清、-MEM培养液)培养，每3 d换液。培养3周后用SABC染色法观察OC、BSP的表达。B. 成脂诱导：取筛选培养的SHED制成细胞悬液，调整细胞密度为1105/ml接种于6孔板中，以含lO%胎牛血清的-MEM培养24 h后换成脂诱导液（地塞米松104mol/L、3-异T基-1-