海带多糖的提取和鉴定实验方案.doc

海带多糖的提取和鉴定实验方案化药：1104 姓名：林文生 学号：110150103一、 实验目的1，掌握酶法提取海带硫酸多糖的原理和操作流程；2，了解多糖物质的常规纯化方法及原理；3，熟悉多糖含量测定的常用方法和原理；4，掌握硫酸蒽酮法测定多糖的原理及操作流程、注意事项；二、实验原理本实验综合利用细胞匀浆和纤维素酶水解，破碎海带细胞壁，释放细胞内容物，包括多糖、海藻酸以及蛋白、核酸等；随后通过海藻酸与Ca2+的结合沉淀形成不溶性海藻酸钙，以去除其中的海藻酸；继而通过CTAB与多糖络合后溶解度下降的特性，将多糖与其他成份分离；最后在盐溶液中回溶多糖，并通过乙醇沉淀法获得多糖沉淀，即为海带粗多糖。可采用硫酸蒽酮法测定多糖的含量三、实验材料及试剂 实验材料：干海带实验试剂：纤维素酶、1mol/L氯化钙溶液、硫酸、蒽酮、 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、 葡萄糖、等仪器：组织匀浆机、水浴锅、台式高速离心机、分光光度计四、实验步骤1干海带加水浸泡过夜，充分溶胀后，加入1/3体积的水，放入组织匀浆机中，粉碎成海带浆。取约100ml海带浆，调PH值为4.5-5.0，加入0.3g纤维素酶，于50度温浴水解4-6小时，间或搅拌，促进细胞壁水解。2.在海带浆中加入50ml水，搅拌均匀，沸水浴5min，使纤维素酶失活，冷至室温，用6层纱布过滤，收集滤液（注：1、这个时候一定不要混入海带渣，防止对后面测量结果的影响， 2、过滤过程中可戴手套挤纱布，但是不要太用力使海带渣意外流出）3向滤液中加入1/4体积1mol/L氯化钙溶液，搅拌均匀后，4层纱布过滤，去除海藻酸钙。（这个时候过滤比较简单，因为海藻酸钙是絮状沉淀，易过滤）4于滤液中加入1/5体积的2%CTAB与海带多糖结合沉淀，12000rpm离心5min收集CTAB-多糖沉淀物。(1.要经过离心的两个管一定要配平，平行操作2.两个管相对放置3.离心参数设置4.记忆)5在CTAB-多糖络合沉淀物中加入0.5ml 2mol/L氯化钾溶液，通过盐解作用，溶解释放海带多糖，然后加入2倍体积无水乙醇沉淀多糖，12000rpm离心5min。五，硫酸-蒽酮法测定海带多糖含量1.配制硫酸-蒽酮试剂:取2g蒽酮溶解于1000ml浓H2SO4中，当日配制使用。2.绘制葡萄糖标准曲线:准确量取100g/ml葡萄糖标准溶液0，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00ml，注入糖管中，补充纯水至1.00ml（下表）。并分别加入4.00ml硫酸-蒽酮试剂，盖塞后立即摇匀，迅速浸入冷水浴中，各管加完后一起置于沸水浴中10min，封口防蒸发，取出流水冷却，室温放置10分钟，于620nm处比色，测定吸光度值。以测得的吸光度为纵坐标，标准葡萄糖含量为横坐标，作出标准曲线。3海带多糖含量测定:将海带粗多糖以适量水溶解（约为10-80ug/ml），并准确量取1.00ml待测溶液，加入4ml硫酸-蒽酮试剂，同标准曲线之操作，比色测定。根据标准曲线计算糖含量。0.2ml2ml（10倍）0.2ml2ml（10倍） 1ml2ml（20倍） 1ml2ml（40倍）实验数据序号123456710倍20倍40倍葡萄糖含量(g/ml)01020406080100823015吸光度A0.280六、注意事项：1. 海带细胞壁以纤维素为主，因此可用纤维素酶水解细胞壁破碎细胞，酶解作用温和，对于细胞内容物成分影响较小。2. 在海带多糖的提取过程中，海藻酸类物质是主要的杂质成分，本实验通过加入Ca2+与海藻酸结合成为不溶性的海藻酸钙沉淀，去除海藻酸，初步纯化多糖。3. CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子表面活性剂，在低离子强度的溶液中具有沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，而在高离子强度的溶液里，CTAB又可与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多糖形成复合物。因此，本实验利用了CTAB沉淀多糖的性质，将多糖与其他成份分离，且这种酸性多糖沉淀物可在一定盐浓度下被重新溶解而不引起其他性质的改变，可用于多糖的纯化4. 多糖中常