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文档简介

高效液相色谱对芥子油苷的提取和分离I 准备阶段： 1. 水浴锅设置80 2.配制两瓶70%的甲醇，其中一瓶置于水浴锅中温浴。 3.5mM苄基芥子油苷.2.33mg/ml 4.0.5M醋酸盐（PH=5）30mlHAC，960ml H2O，加10-20g NaOH粉末，调至PH=5 5.20mM的醋酸盐，PH=5：将4中的稀释25倍 6.DEAE sephadex A-25：称取3g 树脂，加90ml 0.5M 醋酸盐（PH=5）室温过夜溶解。 7.硫酸酯酶：15mg溶解于6ml 20mM 醋酸钠中，PH=5（16100uM/hour/g）II 芥子油提取 1. 取新鲜莲座叶，鲜重5-10mg 2. 放入1.5mlEP管中，迅速放入液氮。 3. 研磨成粉末后并加入1ml 预热的70%的甲醇。 4. 加入50ul 5mM 的苄基芥子油苷 5. 盖好盖子漩涡震荡置于冰上，剩下的样品重复步骤3-4。 6. 所有的样品置于8010min。 7. 4000rpm，10min。 8. 将上清液转移至1.5 的离心管。 9. 用预热的甲醇重新提取两次，收集所有的上清液至4ml，-20保存。III 芥子油苷的脱硫纯化 1. 搅拌DEAE sephadex A-25 树脂成溶液，用1ml的移液器取1ml加入BioRad 管中，让其沉淀。 2. 用5ml 的灭菌水清洗（禁止干燥）。 3. 加入所有的芥子油苷提取液。 4. 用2ml的70%的甲醇清洗两次，2ml 的灭菌水清洗5次，2ml 20mM 醋酸盐PH=5清洗一次。 5. 加入0.5ml 硫酸酯酶，直至上侧的橡胶管中剩余1-2mm的液相。IV 脱硫芥子油苷的洗脱 1. 用1ml 灭菌水洗脱3次。 2. 浓缩至EP 管中剩余0.5ml 液体V HPLC分离脱硫芥子油苷 1. 取60ul 洗脱液于HPLC管中，吸入30ul 2. 检测：PDA 190nm-370nm （或者DV229nm和260nm） 3. 流速：1ml/min 4. 运行梯度：灭菌水（A）和甲醇（B），60min A100%,B0% 2min A to 60%B线性 48min，60%B to 100% B 线性 3min A 0%，B100% 3min B to 100% A 线性 4minVI 芥子油苷的HPLC-MS 5. 取60ul 洗脱液加入HPLC管中，吸入6ul 6. 检测：质谱，M+Na+ 7. 流速：0.25ml/min 8. 运行梯度：混有50uM的醋酸钠灭菌水（A）与甲醇（B），60min A100%,B0% 2min A to 60%B线性 40min，
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