显微镜发展史-共聚焦.doc

共焦显微镜杂记王义闵 国立中山大学物理系研究生魏良安 国立中山大学物理系大学生高甫仁 国立中山大学物理系副教授 335 物理雙月刊（廿三卷二期）2001年4月一、光学显微镜之发展光学显微镜自问世以来，已历经了四百年的演变，对于近代科学的发展有极大的影响。其演进的原动力，来自于人们想清楚地看到肉眼无法分辨之微小物体。于十六世纪，光学放大仅靠单一凸透镜完成，但它的制作也导致了显微镜的发展。显微镜历史上有许多著名的人物，但关于第一台显微镜的滥觞，就不得不提到Antony van Leeuwenhoek。他将小玻璃球抛光成一片透镜（放大率约为270倍），并利用此透镜做出世界上第一台实用的显微镜，在他多产的一生，他建造了约四百台的显微镜。由于他只使用单独一片透镜，所以Leeuwenhoek的显微镜被归类为单一透镜显微镜。现今所谓的光学显微镜一般指复合式显微镜，是由目镜及物镜所组成。十七世纪时，英国人Robert Hooke即利用自行制作的复合式显微镜发现了生物是由细胞所组成。十九世纪时，显微镜的发展已有长足的进步，并奠立了现今显微镜的规格，例如Carl Zeiss致力于显微镜的制作、Ernst Abbe提出了显微光学原理的理论基础及Otto Schott对光学玻璃详尽的研究。时到今日，显微镜的种类与用途已包罗万象，而显微观测技术也随之增进，较重要且广为使用的显微技术包括暗视野（dark field）、相位对比（phase contrast）、差分干涉（differential interference contrast）、偏光（polarized light）、以及荧光显微术（fluorescence microscopy）等。二、荧光显微术与生物医学研究的关联显微术对生物医学发展的影响可谓是空前，但仅凭单纯之空间分辨率并无助于自生物样品撷取太多有用之信息，目前在许多生物样品的观测上，免疫荧光染色（immunofluorescent staining）可说是观测某一特殊蛋白质在局部分布上最具广泛用途和有效的方法。发特定荧光的染料常被接至（chemically bonded）一纯化的特殊抗体（antibody）上，而此染料-抗体之复合分子则在样品上寻找相对于此抗体之抗原（antigen）并结合。如此一来，藉荧光显微成像即可显示此一特殊蛋白质的分布与位置（抗体、抗原皆属蛋白质分子）。另一侦测特殊蛋白质的方法即为借助绿荧光蛋白质（Green Fluorescent protein, GFP）。此种蛋白质首在Aequoroa victoria水母上找到，它的分子量为238，在适当的波长激发下可发出绿色荧光。藉重组染色体的技巧（recombinant DNA）可将产生GFP的基因植入活体培养细胞之中，甚至整个生物的某部分细胞之中。如此，带有并表现GFP基因之细胞即可在一片组织中被清楚地标定出来，而GFP蛋白质在细胞中的移动亦可清楚显现。另外荧光影像亦可用于测定细胞质流体（cytosol）中自由钙离子（Ca+）浓度。钙离子在细胞之新陈代谢上扮演极重要之角色，如肌肉之收缩、讯息之传递等。三、共焦显微镜之发展由于传统的光学显微镜受到光波绕射的限制，致使它无法提供无限的放大能力，其发展一度被宣告终止，且其成像方式依旧是停留在平面成像。传统上，荧光染色之样品系藉由荧光显微镜观测，但由于景深之关系使得荧光显微镜无法仅观测某一断层，以致拍得之荧光影像常显得一团模糊，无法区分染色的部位到底位于何处，比如在细胞膜上或是细胞内部，所以薄切片的制作技术便应运而生。但切片后则无法观测活体样品，且难以显现样品之原状。这个难题直到共焦扫描显微镜发明后才得以解决。共焦扫描显微的原理，一般咸认在1957年时已由Marvin Minsky提出，如图一.所示，但由于当时缺乏适当的光源与数据处理的能力，使得这一原理仍停留在纯理论之阶段，共焦扫描显微技术能真正图一. 共焦扫描显微的原理，摘录自Marvin Minsky所提出之美国专利，其编号为3,013,467。成为一个实用的显微技术则是等到雷射与个人计算机发明以后。在1969年时，Paul Davidovits和M. David Egger利用雷射发展了第一台共焦扫描显微镜，而第一台商业化的共焦扫描显微镜则是到1987年才问世。近十余年来，无论是激光技术或者是个人计算机都有着惊人的发展，使得共焦显微技术更形完备。单光子共焦显微镜的光学理论首由时在英国牛津大学的Colin Sheppard和Tony Wilson提出。美国康乃尔大学的Watt W. Webb等人则于1989年实验上证实了双光子共焦显微镜的独特性，其设计图如图二.所示，并引起了相当大之震撼。随后Colin Sheppard和Min Gu则提出了相对应之双光子共焦显微镜的光学理论。但截至1995年为止，共焦显微镜的理论仍植基于纯量波。在这样的基础上，虽足以应付众多之情况，但对极大NA值之聚焦情形仍无法有圆满之描述，这个困境则是在1996年由Peter Torok提出向量场的成像理论后才加以解决。四、单光子与双光子共焦扫描显微之原理共焦一辞源自于显微镜的物镜焦点与成像透镜（即集光镜）焦点位置相互对称，也就是照明点与探测点在光学成像上共轭，两镜的焦点同时落在观察样品的表面。共焦显微镜的侦测器前拥有”独特”的针孔以行空间滤波，这使得它具备了传统光学显微镜所没有的光学切片能力。其所利用之原理是当光束聚焦在样品之处并不是焦平面时，则自样品反射后的光束，大部分将无法通过光侦测器前的针孔而无法成像；反之，则能产生极强的光讯号。其成像的原理，亦可藉由傅立叶光学做精准的描述。图二. 双光子共焦显微镜设计图，摘录自美国专利编号5,034,613早在1884年时，Ernest Abbe已明确地指出光绕射极限决定了显微镜最大可能之平面分辨率，且根据Rayleigh条件（criterion），Airy光斑决定了可解析的距离，所以传统显微镜之横向分辨率为共焦显微镜由于有了针孔以行空间滤波，因此其横向鉴别率比传统显微镜稍加优越，为在纵向分辨率上，共焦显微镜的优点则显露无遗，其纵向分辨率可表示为 ， 其中为聚焦面介质的折射系数。以传统显微镜对样品作观测，当其偏离焦平面时，会产生散焦的情况，对焦平面所产生的影像造成干扰，而此时像中心的强度亦会随着降低，但经共焦显微镜所取得影像的强度随散焦距离的变化则比传统显微镜剧烈得多。也因此共焦扫描显微镜仅对在聚焦面上形成清晰的影像，若我们逐步移动聚焦面，则可取得观测样品其深浅有序的断面，将这些断面的影像经由计算机处理，即可重组出相对应的三度空间影像。但在实际运用上，共焦的成像常受限于样品的吸收与散射，致使穿透深度与讯噪比深受影响。也因此利用双光子激发之共焦显微镜，其可行性一经证明旋即引起风潮。双光子激发指的就是受激分子同时吸收两个光子1和2，受到能量相当于频率在12的单光子激发，此反应机制不同于分子先吸收一个光子跃迁至中间亚稳态，再吸收一个光子跃迁至最后的激发态。双光子激发的原理早在1931年已由Maria Goppert-Mayer预测，即受激分子同时吸收两个光子而跃迁至激发态，但因同时需两个光子激发，故跃迁率（transition rate）正比于入射光强度的平方，因双光子吸收截面极低，所以需要极高的瞬间功率，才能有效地产生激发，这使得实验上的量测必须等到脉冲雷射发明后才得以完成。双光子激发的非线性光学效应在聚焦处最为强烈，因此双光子激发可说是自然形成之3D过程，不需前述之针孔即可形成空间滤波之效应。图三.为单光子与双光子激发之示意图。图三.（a）在单光子激发机制下，样品中光所经之处皆受到激发。（b）在双光子激发机制下，仅在光束聚焦断面产生激发。对”特性良好”的样品，双光子激发具有如下已广为引述的优点：1.较深的穿透深度，因散射与吸收大幅降低。2.局部化的激发，如图三.所示，在双光子的机制下，仅在焦点附近形成有效的激发，如此可局限光漂白的范围。3.较低的球面像差，因所用的波长较长，故在固定的光程差下，相位差会减小。五、共焦显微镜面临之问题如前所述，以单光子激发获取的光学影像及光谱研究皆会有以下之限制：因Rayleigh散射之关系，当入射光波长愈短时，其穿透深度愈浅。即用短波长之光源时，将无法穿透至材料深层；但若使用长波长光源可能就无法达到有效的激发。这些困境原是双光子激发所欲解决的。历经多年之发展，许多研究群已开始深信双光子共焦显微镜是远较单光子共焦显微镜为佳的选择。不过最近Konig和So等人却发现双光子共焦显微镜所需的超快雷射会造成样品在多光子激发下不正常的损坏。应用双光子共焦显微镜于生物医学样品上，已出现以下的问题：1.光破坏：因强光的照射使得细胞遭到破坏，甚至死亡。单光子激发仅需数百微瓦（W）的能量，而双光子激发却往往需要数个毫瓦（mW）。2.光漂白：因大部分生物样品本身并不会发荧光，所以需加入染料使其发荧光。但若是雷射光强度太强，则会使得染料逐渐漂白而不再发光。双光子激发的光漂白截面虽不见得比单光子激发高，但因所用的功率远高于单光子，故产生的光漂白效应亦不小，即使是光漂白的区域受到局限。这些副作用或许可藉由共振激发加以降低。预期在共振激发的条件下，将可大幅降低多光子激发所需的功率。另外，在低温下我们预期染料的光漂白半衰期亦将大幅增加，且荧光可因减少非辐射性的能量转移而增强，如此一来将可强化多光子激发之优点，但前提是样品必须能在低温的环境下观测。另外Min Gu又从光学的角度上发觉到，若是样品中形成散射的成因并非Rayleigh Scattering而是Mie Scattering，则增长入射雷射光之波长并无助于增加穿透的深度，这使得双光子共焦显微镜并不能在所有的情况下发挥预期的优点。六、发展的方向近几年来共焦显微镜较引人注目的发展约有下列几项：1.倍频与三倍频对比机制的引进。非线性光学和显微技术之结合可谓极自然与相辅相形，因为在聚焦下，非线性光学的效应将可大为增强。而且此效应具有3D之本质，此一本质又正好可以利用在显微成像上。利用非线性光学讯号，如倍频产生可鉴定材料结构的对称性与排列，三倍频则可反应出不同介质的接口影像。2.4全立体角共焦显微镜。此法是由Max-Planck Institute的Stefan Hell发展。借着干涉仪式的显微聚焦架设，他将共焦显微镜的轴向分辨率改进到7倍之多。另外他也发展了Stimulated Emission Depletion Microscopy（STED）的技术，可将空间分辨率提高5倍之多。此法之优点可充分应用于改进荧光显微的分辨率上。3.差动式反射光共焦显微镜。此系由国内汪治平教授与李超煌博士共同完成。藉由侦测反射讯号强度随轴向距离的变化，可达成数个nm的轴向分辨率。4.结合光谱技术的CARS和FRET。如前所述，利用荧光成像仍是共焦显微镜最重要的应用之一。CARS不需要染料即可提供化学鉴别力。FRET系受激分子非辐射性的能量转移，如图四.所示。它的特点是如此转移的效率与分子间距离的六次方成反比，因此对分子间距离的细微变化极为敏感。图四. FRET之能量转移方式5.光致电流或射频光致电流。对于许多光电组件，光致电流提供了一极为独特的显微观测方式。对反应快速的高速光电组件，藉超快激光脉冲产生的射频光致电流可产生极为特殊的对比。6.Adaptive Optics于共焦显微镜的运用。此系由牛津的Tony Wilson所发展，目前已证明有超解析（super resolution）的能力，即空间分辨率可大幅超越Rayleigh条件。7.利用Nipkow Disk产生video rate的影像撷取速度。其它林林总总的改进与发展，亦在世界各地不断地进行，限于篇幅，在此不再赘述。七、结语共焦显微术已在生物医学上证明其不可或缺的角色，随着新的光学、光谱方法或物理机制的引用，可预见雷射扫描显微技术将有更进一步的发展与应用。在光学显微镜漫长的发展历史中，曾有多次被宣告已臻发展之尽头，却总是在新的想法与技术引进后，而进化至一新的境界。我们预期这样的演化将不断上演，且让大家拭目以待。八、参考书目1. T. Wilson and C. J. R. Sheppard, Theory and practice of scanning optical microscopy, (Academic Press, London, 1984).2. C.J.R. Sheppard and D.M. Shotton, Confocal Laser Scanning Microscopy, Springer, New York,(1997).3. M. Gu, Three dimensional confocal microscopy, (World Scientific, Singapore, 1996).4. R. Gauderon, P.B. Lukins, and C.J.R. Sheppard, Three dimensional second harmonic generation imaging with femtosecond laser pulses, Opt. Lett., 23, 1209-1211, 1998.5. Yici Guo and P P Ho and H Savage, D. Harris, P. Sacks, and S. Schantz and Feng Liu, N. Zhadin, and R.R. 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