植物体细胞克隆技术.doc

体细胞克隆技术细胞核移植：就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。 （核移植全属于无性生殖）体细胞核移植(somatic cell nuclear transplantation)技术又称体细胞克隆，它是把分化程度较高的体细胞移入去核卵母细胞中，构建重构卵或重构胚并使之发育为成体的生物技术。它与胚胎克隆技术相比，有两大优点:第一， 同一遗传性状供体核的数量可无限获得；第二， 第二，可通过对供体细胞的遗传改造加速新性状和优良性状的筛选且胚胎移植为有性生殖，而体细胞核移植（即克隆技术）为无性生殖细胞核移植细胞核移植，就是将一个细胞核用显微注射的方法放进另一个细胞里去。机理：供体细胞移入卵母细胞后，在卵母细胞相关因子的作用下，发生了核重编程使其恢复到发育的起点状态。（即在卵母细胞的某些因子诱导下使高度分化的体细胞能够能够再次具有分化的潜能，其状态就像是卵子受精后的细胞核一样，可以让这个“重组细胞“像受精卵一样发育成一个完成个体。）核重编程的过程是使在体细胞中被关闭而在正常胚胎发育中表达的基因重新被激活的过程（因为体细胞虽然有全能型，但是已经高度分化了，有的基因已经表达，而有的没有，于是在卵母细胞中能使其全能性得到充分表达。）总体程序（解说图示，如此图与课件上的不同，在核供体细胞准备后还应该有一个细胞周期的调控阶段）将此表与下列课件上的图比较下解释。克隆羊多利（世界上第一个无性生殖产生的动物）的诞生：步骤一从一只6岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为A）的乳腺中乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止分裂，此细胞称之为“供体细胞”；步骤二从一头苏格兰黑面母绵羊（B）的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”； 步骤三（重点与上图区分，是将体细胞注入受体细胞而不是把体细胞核注入受体细胞，其原因是？理论上来说把细胞核注入到去核卵母细胞中才叫细胞核移植，但实际操作起来比较难。将供体细胞注入去核卵母细胞”比较方便，不用取出细胞核即可，它是利用了细胞膜具有一定流动性的特点，通过离心、震荡、电刺激、灭活病毒等手段使供体细胞和卵母细胞细胞膜融合，成为一个细胞，从而达到将供体细胞核注入去去核卵母细胞的目的。）利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最后形成“融合细胞”。电脉冲可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成“胚胎细胞”； 步骤四将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（C）的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成小绵羊-多莉。不同实验室的条件不同，、处理方法不同，、造成研究材料来源与卵母细胞质量、成熟培养体系、供体细胞类型、供体细胞处理方法、胚胎培养方法、融合激活方案等等因素均会影响核质的同步发育、核的重新编程和发育的启动和延续，进而影响到克隆的效率在众多影响因素中，体细胞和卵母细胞细胞周期协调更是体细胞核移植最为关键的环节，全面探讨供体各方面因素对重构胚的影响至关重要。1. 核供体细胞准备（核供体：体细胞，胚胎细胞，胎儿细胞。选择这些是因为这些细胞的细胞核含有物种全套的遗传物质，有细胞全能性，更易形成新个体。为什么不用生殖细胞？因为生殖细胞中染色体只有体细胞中的一半，且用生殖细胞的话就会是有性生殖了）种类及各自效果评价胎儿成纤维细胞、颗粒细胞、和卵丘细胞的核移植效果成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。颗粒细胞：卵泡中卵母细胞四周有一层菱形或扁平细胞围绕，在卵泡开始发育、卵细胞成长的同时，周围的菱形细胞变为方形，并由单层增生成复层，因其细胞浆内含有颗粒，故称为颗粒细胞。颗粒细胞的胞核大而圆，着色深，细胞的游离面有许多细长突起伸入放射带的凹陷部。（如下图是一个卵子细胞，颗粒细胞组成其放射冠）研究结果表明：（1）比较胎儿成纤维细胞、颗粒细胞和卵丘细胞的核移植效果发现，胎儿成纤维细胞的融合率（64.74%）高于颗粒细胞的融合率（51.05%）和卵丘细胞的融合率（56.89%）。因此，一般多用成纤维细胞为供体细胞。胎儿成纤维细胞的核移植效果的研究发现，69代的融合率显著高于35代和10代的成纤维细胞。而一般细胞在体外都可以传代次。对供体细胞的处理细胞周期的调控（是为了是核质协调，细胞周期协调更是体细胞核移植最为关键的环节，影响核质的同步发育、核的重新编程和发育的启动和延续，进而影响到克隆的效率）方法：血清饥饿法，阿菲迪霉素法，激活卵母细胞法血清饥饿法：这一种使细胞同步化分裂的方法。通过降低培养液中的血清浓度，使培养细胞因缺乏血清生长因子而不能分裂，一定时间后再加入血清，细胞就开始同步生长分裂了。通过血清饥饿，我们可以获得大量的期的细胞，使其不进入分裂的期。阿菲迪霉素法：Aphidicolin是一种菌种中分离出来的四环二萜类抗生素和 DNA 合成抑制剂的化合物，能够通过结合酶，特异性地抑制 DNA 聚合酶 和 而不影响其它 DNA 聚合酶。这种化合物能够在 S 早期阶段阻滞细胞周期，使细胞同步化在期。 激活卵母细胞法：即使未移入供体细胞前，将卵母细胞的MRF活性抑制，以便为后来重构胚的发育做准备。受体卵母细胞准备2.1 （核受体：MII期的卵母细胞（一般通过超数排卵和体外成熟培养获得），早期胚胎细胞，去除原核的受精卵）（其中我们为什么一般采用动物的卵细胞做核受体呢？是因为大部分细胞的细胞质中含有抑制细胞核的全能性表达的蛋白质，而卵细胞中没有这种物质，因此使用卵细胞能促进细胞核的全能性表达。又为什么采用期的卵母细胞呢？是因为此时的卵母细胞进入输卵管，并停留在第2次成熟分裂中期，此时染色体都集中在赤道板位置，容易去除染色体，即去核过程会比较好操作，而且此时的细胞才具备受精能力，更容易接收外源染色体，且此时卵母细胞，因为处于MII期的卵母细胞中含有较高的成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)活性，是分化的体细胞进行去分化进而重新编程所必需的，卵母细胞此时体积较大，容易操作，且营养物质较多。一般不会采用受精卵作为核受体的，因为核移植是无性生殖的过程，而且用受精卵的话还要先去核，多此一举。）2.2去核的方法： 1.盲吸法 2.半卵法 3.荧光引导合法 4.微分干涉显微镜去核法 5.功能性去核法 6.离心去核法 7.末期去核法下面介绍下主要的几种技术：1.盲吸去核法1983年McGrath和Soher在小鼠核移植中创立此法。先用细胞松弛素B(CytochalasinB)等细胞骨架抑制剂处理卵母细胞。由于新排出的卵，其核与第一极体呈对位关系，用固定管在第一极体对面吸住卵母细胞，将去核针刺穿第一极体附近的透明带，吸出第一极体及其附近的适量胞质(1/41/3为宜)，即完成去核。该法的不足在于造成胞质流失和一些重要因子的丢失，从而影响到核的重编程和重构胚的后续发育，此外还给卵母细胞带来机械损伤。（需要熟练地操作技术）2. 末期去核法以往卵母细胞去核均在减数分裂的M期进行，而Bordignon(1998)却在牛卵母细胞成熟30h后，用酒精激活，使其排出第二极体，然后去掉第二极体和附近的少量胞质，这就是末期去核法。结果发现末期去核无论是去核率还是胚胎发育率均高于M期去核(P001)。此外，末期去核还有时间同期化、去除胞质少、有利于重构胚发育、而且选择的是活化卵子，可筛选掉质量不高的卵子等优点。4.化学诱导去核法其机理是在极体排出阶段，采用干扰染色体分离或纺锤体功能的化学试剂，使所有染色体与纺锤体牢固结合同时蛋白合成抑制剂抑制细胞周期蛋白B合成，降低促成熟因子浓度，极体借助于惯性将染色质和纺锤体带出胞外，达到去核的目的5. 有些方法因弊端明显或操作繁琐现已很少使用，除非特殊情况，如功能性去核法、离心去核法。3.装核（视频展示）即将准备好的体细胞放入去核卵母细胞的过程。如图示，如视频示。4.细胞融合 病毒介导，化学，及电融合，重点介绍下第三个电融合一种将悬浮细胞在低压交流电场中，细胞被极化成为偶极子，造成细胞之间相互交联，尽量使两细胞处于点接触，即将培养细胞形成单层接触（要注意控制好电流强度），然后加高压电脉冲，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点的质膜，此时质膜脂类分子发生重排，由于细胞表面张力作用，使两细胞逐步融合的技术。供体细胞和受体细胞之间进行细胞融合后会形成重构卵或重构胚。5.重构卵激活与重构胚的培养5.1重构卵的激活正常情况下，受精过程中，精子进入卵子后，卵母细胞质中会出现一系列的反应，如Ca离子浓度上升，母源性mRNA启动转录、MPF活性下降等都是代表着卵母细胞被激活的标志，这样形成的胚胎才能正常发育。（其中高活性的MPF是使卵母细胞停滞在第二次成熟分裂中期的关键因素，是卵母细胞向下不能发育，因此激活卵母细胞必须要是MPF活性下降。）而我们核移植中的重构卵的激活就是模仿了受精过程中精子的刺激作用。 目前，激活的方式有电激活（在融合液中电脉冲激活），化学激活和注射精子因子激活（即将精子提取物注入卵母细胞）三种。其中最常见的是化学激活中利用离子霉素联合六-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)来抑制MPF活性