组化染色综合版-2.doc

瑞氏-姬姆萨染色Wrights-Giemsa Stain4.2试剂（1）瑞氏-姬姆萨复合染色液（I液）瑞氏染色粉1g，姬姆萨染粉0.3g，甲醇（A.R）500ml，中性甘油3.3ml。将瑞氏染粉和吉姆萨染粉置洁净研钵中，加中性甘油研磨，再放入37孵箱孵育24小时后，加入少量甲醇研磨，吸出上液，如此连续几次，共用甲醇 500ml 。收集于棕色玻璃瓶中存放一周即能使用。存储时间越久染色效果越好。中性甘油可防止甲醇挥发，使细胞染色较清晰。（2）磷酸盐缓冲液（II 液）（pH6.46.8）磷酸二氢钾(K2HPO4)6.64g，磷酸氢二钠(Na2HPO4。12H2O)2.56g，用磷酸盐调整 pH，加蒸馏水至1000ml。 6. 操作方法（1）染色 将玻片滴加瑞氏-姬姆萨复合染色液（I液）35 滴，使其迅速盖满涂片，再按1：1或1：2的比例滴加磷酸盐缓冲液（II 液），轻轻摇动玻片使染液充分混合。9正常结果范围及结果解释1. 染色结果偏酸者，则红细胞和嗜酸性颗粒偏红，白细胞的核呈浅色或不着色。2. 染色结果偏碱，所有红、白细胞染灰蓝色，颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色甚至黑紫色或蓝色。中性颗粒也偏碱（紫黑色）。遇此种情况应更换缓冲液。铁粒染色（Iron Stain）2实验原理正常人骨髓中以含铁血黄素的形式储存的铁粒属细胞外铁；而幼红细胞的胞质中含有的铁颗粒属于细胞内铁，这种细胞称为“铁粒幼细胞”。骨髓中细胞外铁和幼红细胞内的铁颗粒与酸性亚铁氰化钾溶液作用，发生普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化钾沉淀，定位于含铁的部位。4.3试剂配制4.3.1酸性亚铁氰化钾溶液4.3.1.1 把200g亚铁氰化钾溶于1000ml蒸馏水中。4.3.1.2 取5ml 200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入1ml浓盐酸。临用前新鲜配制。4.3.2 2g/L核固红硫酸铝溶液取硫酸铝10g加入100ml DH2O再加入核固红EMER出品 0.2g，置于37水浴中1小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。贴上“2g/L核固红硫酸铝溶液”的标签并注明配制日期和失效日期。室温保存。 5.2. 质控标准正常的阳性结果为：外铁为，铁粒幼红细胞20%。6操作方法6.1选骨髓小粒丰富的骨髓涂片，用甲醇固定10分钟。（这一步骤可省略）6.2玻片上滴加酸性亚铁氰化钾，染色30分钟。（可置于37）。6.3用DH2O冲洗后用核固红染液复染1015分钟。6.4流水冲洗，晾干，油镜检查。6.5 先用低倍镜判断细胞外铁，再用油镜计数100个幼红细胞，观察铁颗粒的多少。7结果报告7.2.1细胞外铁的判断用低倍镜观察涂片的骨髓小粒，根据骨髓小粒和巨噬细胞的胞质内出现的蓝色颗粒状、小珠状或团块状的多少，把细胞外铁分为五级。无颗粒有少数铁颗粒或偶见铁小珠有较多的铁颗粒和小珠有很多的铁颗粒，小珠和少数小块状有极多的铁颗粒，小珠并有很多的小块，密集成堆7.2.2 铁粒幼细胞的判断:胞浆内出现蓝绿色颗粒的幼红细胞即为铁粒幼细胞。阳性程度的标准为： 型仅含1个铁颗粒 型含25个铁颗粒 型含69个铁颗粒 型含10个以上的铁颗粒7.2.3 环形铁粒幼细胞的判读标准：含铁颗粒6个以上，其中2/3以上的铁颗粒围绕核周围排列成完全环形或不完全环形（围绕核周围指分布紧靠着细胞核或靠近细胞核的1/3胞浆内，铁颗粒增多时，可分布于外2/3的胞浆内。8结果解释8.1正常人细胞外铁：。幼红细胞染为鲜红色，胞浆成淡黄红色，铁粒呈蓝绿色，定位于胞浆中含铁的部位。8.2 缺铁性贫血时，骨髓细胞外铁和内铁显著减少或消失，铁粒幼红细胞阳性率为016%，平均为4%，铁颗粒极少并着色浅，以型为主，型者极少，型以上者不见。8.3 溶血性贫血，巨幼红细胞贫血，脾亢，AA，AL，慢性肾炎伴尿毒症和多次输血等病人的细胞外铁可以增高，细胞内铁以型和型为主，可以见到型，不见型。因此有助于鉴别IDA与非IDA。8.4是诊断铁粒幼红细胞贫血的重要依据，能发现数量不等的环状铁粒幼红细胞，并且多见粗颗粒的型和型铁粒幼红细胞。8.5骨髓增生异常综合征时，细胞外铁丰富。铁粒幼红细胞的百分比增高，常见环状铁粒幼红细胞。在铁粒幼细胞性难治性贫血中，环状铁粒幼红细胞15%时，对诊断有重要意义。9注意事项9.1玻片必须经无铁处理：将新玻片经清洁液浸泡24小时，取出后反复水洗浸入95%酒精24小时，晾干，再浸泡在5%盐酸中24小时，用DH2O反复洗玻片，取出烤干后备用。9.2酸性亚铁氰化钾液必须新鲜配制。9.3最好用骨髓小粒丰富的骨髓涂片进行染色并作细胞外铁观察。过氧化物酶染色Peroxidase Stain (Pox)2实验原理粒细胞和一部分单核细胞胞浆内含有过氧化物酶，此酶可将底物中的过氧化氢分解，产生新生态的氧，使联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物。其蓝色或棕色的过氧化物酶阳性颗粒定位于胞浆中。4.3 试剂配制4.3.1. 复方联苯胺（Washburn）染液将1ml 36的亚硝基铁氰化钠溶液与99ml的无水乙醇混合，再加入0.3g联苯胺，使其溶解。室温保存。4.3.2. 3%过氧化氢3ml30%的过氧化氢和27ml蒸馏水混合，配制成3%的过氧化氢。室温保存。4.3.4. 稀过氧化氢把1滴3%的过氧化氢溶液加入5ml蒸馏水中，用时新鲜配制。5.2. 质控标准正常的阳性结果为：中性分叶粒细胞胞浆内充满粗大而密集的蓝黑色颗粒。5.3. 失控措施如果质控涂片的结果不能接受，应进行以下的检查：5.3.1.重新制作一张新鲜的质控血涂片。5.3.2.检查双氧水的浓度。5.3.3.检查试剂温度和pH是否正确。 5.3.4.检查试剂是否失效。5.3.5.重新配制试剂后再进行染色。6操作方法6.2. 于新鲜干燥的涂片上滴加复方联苯胺染液38滴，使涂片盖满。6.3. 12分钟后加入等量的稀过氧化氢溶液。6.4. 48分钟后用水冲洗，空气中晾干。6.5. 用瑞氏染液复染，干后用油镜观察。6.6. 油镜下计数100个原始细胞，计算原始细胞的阳性率。7结果报告7.2. 结果判读标准如下： 阴性：无颗粒。 弱阳性：颗粒小，分布稀疏。 阳性：颗粒中等大小，有少量堆积分布。 强阳性：颗粒粗大，堆积分布。8结果解释8.1. 过氧化物酶的阳性颗粒呈蓝色或蓝黑色，定位于胞浆中。8.2.原粒细胞通常是过氧化物酶阳性，而淋巴细胞是阴性。8.3. 不仅粒细胞和单核细胞中的嗜天青颗粒是阳性反应，而且嗜酸和嗜碱细胞的特异性颗粒也是阳性。Auer rods也为过氧化物酶阳性。8.5. 原粒细胞的过氧化酶阳性颗粒较多较粗；单核细胞的颗粒细小弥散。然而大多数的原单核细胞过氧化物酶呈阴性反应。8.6. 已证实一些骨髓增生异常综合征的病人和遗传性过氧化酶缺乏的病人，其中性粒细胞的过氧化物酶为阴性。9注意事项9.2. 血涂片和骨髓片都应新鲜制备,血涂片的放置时间不能超过6小时。9.4. 过氧化氢需新鲜配制，若涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，表示浓度过高；/若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则可能示其无效。9.5. 试剂应置于低温暗处或用棕黑色纸遮蔽，防止光线照射失效。中性粒细胞碱性磷酸酶染色（Alkaline Phosphatase Stain）2实验原理细胞中的AKP在pH9.59.6缓冲液中能使基质中的磷酸萘酚钠水解，释放出萘酚。后者与一种稳定的重氮盐（常用有固紫Fast-Garnet，GBC或固蓝RR）偶联，生成不溶性的偶氮染料，沉积于细胞上。4.2试剂 1-磷酸萘酚钠； 2。 固酱紫； 3。 tris(三羟甲基胺基甲烷)缓冲液0.05mol.L-1 pH9.1； 4。95%乙醇； 5。甲绿4.3配制4.3.1.tris(三羟甲基胺基甲烷)缓冲液（1）A液（0.2 mol.L-1 Tris）称取2.428克Tris（MW121.14）溶于100毫升蒸馏水中。（2）B液（0.1mol.L-1 HCL）把0.84毫升37%的盐酸加入蒸馏水中，使成100毫升。（3）pH9.1的0.05mol.L-1的tris缓冲液A液25毫升加B液5毫升，加蒸馏水至100ml。贴上“tris缓冲液0.05mol.L-1 PH9.1”的标签并注明配制日期和失效日期。4保存。4.3.2. 基质液称取2.5毫克的-磷酸萘酚钠，溶于20毫升蒸馏水中，再与20毫升 0.05mol.L-1的tris缓冲液混合，最后加入固酱紫40mg，立即溶解混匀。临用前新鲜配制。4.3.3. 2%甲绿溶液称取1克甲绿溶于100毫升蒸馏水中。贴上“2%甲绿”的标签并注明配制日期和失效日期。室温保存。5.2. 质控标准正常的阳性结果为：中性分叶细胞胞浆内有较多的粉红色或红色的颗粒。6操作方法6.1.涂片在95%乙醇中固定10分钟。6.2.在涂片上滴加新配制的基质液，在室温或37作用30分钟，快速水洗。6.3.2%甲绿复染5分钟。6.4. 油镜下计数100个成熟中性粒细胞，先计数有几个阳性，算出阳性百分率，再将全部分数相加，算出积分数。7结果报告7.1. 在证实了质控标本的结果可靠性后，才可以出具报告结果。7.2. 结果判读标准如下： 根据染色的强度和红色颗粒的多少，共分为以下5级。特 点分 数胞浆内无红色的颗粒0弥散的红色，偶见颗粒1弥散的红色，有中等量的颗粒2显著的红色，有较多的颗粒3显著的红色，有充满胞浆的粗大颗粒4计数100个成熟中性粒细胞，先计数有几个阳性，算出阳性百分率，再将全部分数相加，算出积分数。8结果解释8.1. AKP染色时，细胞核染淡绿色，阳性颗粒呈红色或棕红色，定位于胞浆中。8.2.AKP的参考值各地的报道差异极大，一般认为成人阳性率为1040%，积分为1380之间，小儿稍高，60岁以上老年人较低。8.3.AKP只存在于成熟的中性粒细胞中，特别是中性分叶细胞。网状细胞，骨髓基质也会出现阳性。8.4.AKP升高：在化脓性感染，类白血病反应，骨纤，PR，ALL，CML-BT，MM，神经母细胞瘤，AA，ITP，淋巴瘤，妊娠期，垂体-肾上腺皮质功能亢进和应用肾上腺皮质激素时AKP积分值均升高。8.5.AKP降低：CML，AML，M6，PNH，SLE，绿色瘤，淋巴肉瘤，网状内皮细胞增多症，恶性贫血，病毒感染，传单。8.6.AKP染色对以下疾病的鉴别诊断有一定参考价值：8.6.1.CML与类白血病反应：CML时AKP明显降低，积分常常为零，一般积分小于13分，个别CML病人的AKP可以增高；而类白血病反应时则显著增高，积分值常在200以上。8.6.2.PNH与AA：前者常降低；AA常增高，如果中性粒细胞愈少，贫血愈重，AKP则愈高。病情好转时AKP则下降。C.CML下降；ALL增高; 白血病前期与增生性AA：前者可降低；后者可增高。9注意事项9.1.固定液的选择：一般认为以95%乙醇较满意，但细胞易破碎，可用10%甲醛甲醇液结果满意。9.2.涂片应新鲜，厚薄适宜，标本保存过久，酶活性减低，一般在一周内进行染色观察。9.3.涂片经温育后，要用水快速冲洗，否则会影响结果。过碘酸-雪夫反应Periodic Acid-Shiffs(PAS)2实验原理过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成双醛基，醛基进而与Schiff氏液反应，使无色品红变成紫红染料而附着于含糖的组织上。4.3配制4.3.1.10g/L高碘酸1g高碘酸和100ml蒸馏水混合，配制成10g/L高碘酸溶液。贴上“10g/L高碘酸”的标签并注明配制日期和失效日期。4保存。4.3.2.Schiff染液蒸馏水100ml煮沸后，待片刻，加入碱性品红0.5g，振荡数分钟使品红溶解，冷至50加入1M的盐酸20ml，混匀。待冷却至25加入偏重亚硫酸钠0.5g，混合，置于带塞的棕色瓶中，放于暗处24小时，染液应为无色。如为微红则加活性炭12g，混合过滤，如过滤液仍有红色，应再加少许活性炭，至红色完全被吸收为止。贴上“Schiff染液”的标签并注明配制日期和失效日期。4保存。4.3.3.苏木素液将苏木素0.9g溶于10ml95%的乙醇，20g钾明矾溶于DH2O200ml中（可加热），然后将苏木素液加入明矾液中混合，用强火煮沸后加氧化汞0.5g，迅速搅拌，成深紫色，迅速移入冷水中，次日过滤，临用时取此液95ml加冰醋酸5ml，可使细胞着色清楚。室温保存。5.2. 质控标准正常的阳性结果为：中性分叶细胞胞浆呈弥散的红色。6操作方法6.1将新鲜血片或骨髓片用95%乙醇固定10分钟。6.2.10g/L过碘酸液作用20分钟。6.3.DH2O洗涤几次，晾干。6.4.Schiff染液，60分钟。6.5.用自来水洗涤15分钟（细水长流冲洗）。6.6.苏木素染液10分钟。6.7.自来水冲洗15分钟，待干。6.8.油镜下计数100个原始细胞，计算原始细胞的阳性率，并根据反应强度计算阳性积分。当幼红细胞为阳性时，则计算幼红细胞的阳性率，并根据反应强度计算阳性积分。7结果报告7.2. 结果判读标准：7.2.1中性粒细胞：胞浆内呈淡红色，无颗粒胞浆内呈粉红色，有少量的细小颗粒胞浆内呈片状深红色胞浆内呈深紫红色计数100个成熟中性粒细胞，先计数有几个阳性，算出阳性百分率，再将全部分数相加，算出积分数。7.2.2.淋巴细胞：胞浆内呈弥散淡红色或有少数颗粒（小于9个）胞浆内弥散较深的淡红色或有少数颗粒（大于10个）胞浆内有较粗颗粒或少数小块或大块红色物质胞浆内有多数细颗粒并有大块红色物质计数100个淋巴细胞，先计数有几个阳性，算出阳性百分率，再将全部分数相加，算出积分数。7.2.3.有核红细胞：胞浆内有少数分散颗粒或呈淡红色胞浆内有110个浓的颗粒环或中度红色胞浆内有1120个较粗颗粒或深红色胞浆内有大量浓的颗粒环或深红色计数100个有核红细胞，先计数有几个阳性，算出阳性百分率，再将全部分数相加，算出积分数。7.2.4.巨核细胞：胞浆内没有糖元，但胞浆内弥散着色，此系其它糖类物质含少量糖元，含数小块糖元，糖元常定位于近核膜胞浆内含有中等量的糖元，许多小块或少数大块糖元胞浆内含有大量糖元，呈大块状，其总面积约占胞浆面积的1/5以上8结果解释8.1 糖原阳性反应，胞浆呈红色，阴性反应，胞浆呈无色。8.2粒细胞系统：随着细胞发育成熟而阳性增强，成熟中性粒细胞阳性最强，浆中充满细小的红色颗粒。原粒和早幼粒细胞含有很少的阳性颗粒，胞浆呈淡红色。嗜酸和嗜碱粒细胞的胞浆呈糖原阳性，但特异性颗粒为糖原阴性。在急性粒细胞白血病时，原粒细胞PAS为阴性，早幼粒细胞可有分散的很细小的阳性颗粒。慢性粒细胞白血病时，糖元积分正常，CML-BT时，原始粒细胞可为PAS阳性，因此有人将血象中出现PAS阳性的原始粒细胞增多作为CML可能要急变的一个指标。8.3 红细胞系统：正常血片和骨髓中RBC不染色。正常时骨髓中各期幼红细胞均为阴性。在骨髓增生异常综合征和红白血病时，有核红细胞一般呈较强的PAS反应和积分较高。原红细胞的颗粒可呈弥散的散大颗粒。8.4正常时单核细胞的胞浆染成淡红色，可含有细小的阳性颗粒。在急性单核细胞白血病时，原单和幼单的阳性率和积分可以较高，颗粒细小。在急性粒-单核细胞白血病时，原粒常为阴性，而原单和幼单的阳性颗粒细小而且弥散于胞浆中。8.5正常的淋巴细胞糖原染色为阴性，但有极少数的淋巴细胞可为阳性，在淋巴细胞的胞浆内可见少许小的淡红色或红色颗粒。在B-淋巴细胞增生性疾病时，其糖原阳性增加，特别是在儿童的急性淋巴细胞白血病时。对于T细胞而言，其糖原反应常呈弱阳性或阴性。8.6 正常的骨髓中，巨核细胞的胞浆内呈弥散红色或深红色，血小板染成深红色。8.7 组织细胞阳性颗粒较粗，可呈细长的纤维状或棒状，分布于胞浆较丰富的一端。8.8 贫血：IDA与重型地中海贫血的有核红细胞呈较强的糖元反应；/在轻型地中海贫血，溶贫，CL，AL，PNH和淋巴瘤中，有核红细胞则呈弱阳性。/AA，巨幼红细胞贫血，红细胞增多症为阴性。8.9. Reed-Sternberg细胞和不典型巨核细胞的鉴别，前者阴性或很弱的阳性，后者强阳性。8.10. Gaucher细胞与Niemann-Pick细胞的鉴别：前者PAS强阳性，后者阴性或很弱的阳性。9注意事项9.2 Schiff液尽量不与空气接触，以免染液还原。9.3 用不同厂的碱性品红配制Schiff液可有不同的结果，应注意选用。偏重亚硫酸钠或用重亚硫酸钠的量要充足，此药易于分解，若刺激性气味不强或消失，表明该药变性已不能使用。9.4 对照可用同一标本一片，经固定后加新鲜唾液，置于3730分钟后用水冲洗，再按上法染色，糖元可被唾液淀粉酶水解，使反应呈阴性。-醋酸萘酚酯酶染色-Naphythyol Acetate Esterase2实验原理 细胞中-醋酸萘酚酯酶将-醋酸萘酚水解，产生-萘酚，再与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于有酯酶活性部位。4.3配制4.3.1. 磷酸盐缓冲液（1）A液 称取磷酸氢二钠(含12H2O)2.388g加蒸馏水至100ml。（2）B液 称取磷酸二氢钾0.908g加蒸馏水至100ml。（3）pH7.6的0.067mol.L-1的磷酸盐缓冲液A液25毫升加B液5毫升，PH应为7.6。如果PH不为7.6，则通过调整A液或B液的量，使PH达到7.6。4保存。4.3.2. 10g/L-醋酸萘酚（1）A液 将50毫升丙酮与50毫升蒸馏水混合。（2）称取1克-醋酸萘酚溶于100毫升A液中。4保存。4.3.3. 基质液0.067mol.L-1 pH7.6的磷酸盐缓冲液50ml，加入10g/L-醋酸萘酚1.0ml，充分振荡，直至最初产生的浑浊物大部分消失为止，加坚牢蓝B50mg，振荡，过滤。临用前新鲜配制 4.3.4. 2%甲绿溶液称取1克甲绿溶于100毫升蒸馏水中。室温保存。5.2. 质控标准阳性结果为：单核细胞内有灰黑色或棕黑色弥漫性或颗粒状沉淀。6操作方法6.1.新鲜干燥涂片置于染缸中，在37孵箱中用甲醛熏蒸10min，流水冲洗5min，待干。6.2.放入基质液（37）1h，水洗。6.3.20g/L甲绿水溶液复染515min，充分水洗，待干，镜检。6.4.