细胞工程考试重点.doc

生物工程：一般称生物技术：以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。换言之利用生物体（从微生物到高等动物）或其组成部分（器官、组织、细胞等）发展新工艺或制造新产品的一种科学技术。 理论基础：细胞全能性;有丝分裂的均等性。植物组织培养流程外植体-诱导培养-愈伤组织-继代培养 -再分化-再生植株-驯化移栽-大田胚胎培养(embryo culture):指成熟的胚的离体培养器官培养(apparatus culture):这是一个较为广泛的概念，包括来自于根尖、茎尖、叶原基、花器官的各部分原基或成熟的花器官的各部分以及未成熟果实的培养.茎尖培养(stem tine culture):为较小的仅带几个叶原基或少量幼叶的茎端部分的培养。通常用 ll0毫米大小的茎尖外植体来加速植物的无性系繁殖。在概念上要把茎尖培养与生长点培养分开。悬浮培养(suspend):主要是指在液体培养基中，由保持良好分散状态的单个细胞和小的细胞集聚体的培养。出于它们的状况还没有达到形成一个组织的水平，故有时也称之为细胞培养。这一术语也适用于指进行单个细胞生长的各种试验。细胞的全能性(totipotency):在离体培养下，植物的体细胞或性细胞被诱导发生器官分化和再生为具有与母体植株相同遗传信息的植株的能力。外植体(explant): 一般指用于发生一个培养无性系的植物或器官的切段。当进行继代培养，将培养组织切开移入新的培养基时，这样的一种切段(或分割的部分)也可称之为外植体。愈伤组织(callus):从植物各种器官的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。继代培养(subculture):由最初的外植体上切下新增殖的组织，继续转入新的培养基上培养。按照类似的方式，外植体可以经过连续多代的培养。无性繁殖系(asexual reproduction system ):由同一个外植体反复进行继代培养后所得一系列的无性繁殖后代即无性繁殖系。在细胞培养中，由单细胞形成的无性系则可称之为“单细胞无性系”。器官发生(organogenesis):在组织培养或悬浮培养中，由培养物形成芽或形成根的现象。 维管结节: 在愈伤组织培养中，在愈伤组织内出现的一种由维管组织细胞所组成的细胞团。胚状体(或不定胚 embryoid):为培养过程中由外植体或愈伤组织产生的与正常受精卵发育方式类似的胚胎结构现象。根据其发育阶段不同也可采用正常合子胚胚胎发育各时期中的常用术语，如原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚等来描述。分化(differentiation): 导致细胞或组织形成不同结构并引起功能或潜在发育方式改变的一种过程。脱分化(dedifferentiation ):已分化的细胞在一定因素作用下重新恢复分裂机能并改变原来的发展方向而沿着一条新的途径发育的过程。在脱分化过程中，细胞失去其原有的结构和功能而形成为一种新的组织(如愈伤组织等)。再分化(redifferentiation):把脱分化的细胞团或组织经重新分化而产生出新的且行特定结构和功能的组织或器官的一种现象。第1章 绪论植物细胞工程:通过细胞培养、融合等细胞水平的操作,或者通过基于细胞全能性的非细胞水平的离体培养或操作,以达到改良品种或生物产品目的的一种技术.植物组织培养中由于接种外植体的不同,可以分为以下几类：1植株培养(plant culture)2胚胎培养(embryo culture)3器官培养(organ culture)4.组织或愈伤组织培养（tissue of callus culture）5.花药或花粉培养6.细胞或原生质体培养 (suspension culture) 1957年。Skoog和Miller等提出了激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，即：A/C,这一比率高时促进生根，低时促进芽的分化，二者浓度相等时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长。1958年，一个振奋人心消息传向世界各地，那就是美国植物学家斯蒂瓦特(steward)等人，用液体悬浮培养法把胡萝卜的体细胞经胚状体的发育途径，终于得到了完整植株，同时能开花、结实，使哈伯兰特在五十年前的预言细胞的全能性得到了证实。特别是六十年代韧料金(cocking)等人开始用真菌的纤维素酶分离植物原生质体获得成功，为近年来不断发展的原生质体融合技术、体细胞杂交等遗传工程的迅速发展创造了条件。第2章 细胞工程研究的基本设备和操作技术（关于灭菌的知识最好看看原来的课件多了解一下，这里不再赘述）各种灭菌方法：干热灭菌；湿热灭菌；熏蒸灭菌；过滤灭菌；药剂灭菌；烧灼灭菌；照射灭菌培养基的成分：目前，大多数植物组织培养中所用的培养基由无机营养物、有机营养、植物激素类 和附加物类等组成。1）无机营养物：无机营养物包括大量元素和微量元素。2）有机营养： A、碳源和能源 B、有机氮源 C、生理活性物质 3）植物激素类 通常附加于培养基中的激素有两类： 生长素：常用的有2,4-D(二氯苯氧乙酸) ，萘乙酸(NAA)，吲哚乙酸(1AA)，吲哚丁酸(IBA)等； 细胞分裂素：常用的有激动素（KT），玉米素(ZT)，6苄基嘌呤(6BA)，Z-ip(异戊烯氨基嘌呤)、TDZ（苯基噻二唑基脲）等。活性：2,4-DNAAIAA ZT6-BAKT腺嘌啉诱导脱分化：较低浓度的2,4-D就可以成功地诱导产生愈伤组织。如果将2,4-D等生长素类物质与细胞分裂素配合使用时，其效果会更好。诱导再分化：细胞分裂素为主，配合一种生长素效果更好。植物激素的应用规律1、先生长素后细胞分裂素处理，利于细胞分裂而不利于分化；2、先细胞分裂素后生长素处理，细胞分裂也能分化；3、生长素和细胞分裂素同时处理，分化频率提高。此外，还有三类激素：赤霉素（GA3）、乙烯（C2H4）、脱落酸（ABA）第3 章植物细胞工程方法与条件一、 固体培养 固体培养的培养基是由培养基中加入一定的凝固剂配制而成。优点：简便，实验设备要求简单；对于细胞系的起动和保持较为方便，同时它也是进行器官培养，胚胎培养及研究器官发生的常用方法。缺点： （1）外植体或愈伤组织只有一部分表面能接触培养基，当外植体周围营养被吸收后就容易造成培养基中营养物质的浓度差异，影响组织的生长速度。（2）外植体插入培养基的部分，常因气体交换不畅及排泄物质(如分泌单宁酸等褐色物质)的积累影响组织的吸收或造成毒害。（3）还有象光线分布不均匀及很难产生均匀一致的细胞群体等缺点。二、 液体培养定义：培养在不加琼脂的液体培养基上。特点：1、液体悬浮物则是由细胞团、细胞球和单细胞的混合物组成；2、在液体培养中，培养物的生长速度要比培养在琼脂培养基上的快得多；3、由于在液体培养基中较易控制环境，且大多数的细胞处于培养基的包围之中，所以细胞材料在生理上更为一致。液体培养又可分为静止液体培养和振荡液体培养 组织培养的主要环境因素是光照、温度和湿度，其中影响最大的是光照和温度两个方面。第四章 植物细胞全能性和脱分化、再分化（重点）生命周期：自然界中植物由合子实现其细胞全能性的过程，包括孢子体和配子体的世代交替-植物个体发育史。（可无性繁殖实现）细胞周期：植物细胞在分子水平上其细胞全能性的保持和实现，即遗传信息传递的中心法则。通过细胞核和细胞质互作完成的，也称核质周期。组织培养周期：是与母体失去联系的植物细胞实现其细胞全能性的过程，需人为提供营养条件。三个周期的关系：三个循环不是孤立存在的，生命和组织周期是在细胞周期基础上进行的；有细胞获得的克隆基因可转入组织培养周期进行表达；通过组织培养周期获得的具有的优良性状的植株，可在生命周期中经过无性繁殖得以增殖和扩大。组织培养周期中植物细胞表现全能性实现过程：成熟细胞分生芽完整植株。成熟细胞分生细胞胚状体完整植株体细胞胚、胚胎发生型）。成熟细胞愈伤组织出根出芽完整植株（器官发生型）。不但植物体细胞可以表现全能性，花粉在培养条件下也可能进行脱分化，通过愈伤组织或胚状体发育成单倍体植株。动物与植物细胞区别第一，自养与异养的差别高等动物是需要多种复杂营养的异养生物，它们从复杂的来源中吸收、消化和同化其营养，并通过血液将养分输送到全身细胞和器官高等绿色植物是自养的，对营养的要求较简单，因此培养基的成分大部分为无机物和少量简单有机物。第二，外界环境的差别动物细胞直接所处的内部环境，以相对浓缩的形式来满足其营养要求。植物所处的环境变化大，它吸收养分是以稀释的状态。植物细胞束缚在纤维素壁内，内部液泡保持相当稳定的成分。植物细胞又以很大的能力维持着大的液泡、原生质与外界培养基进行物质交换。第三，胚胎得到养分的方式不同动物胚靠预先存在卵里的营养发育，靠胎座与母体联系，植物胚获得营养方式相对地简单，胚存在于胚囊和胚株中，通过胚乳供应胚的养分，原胚与子叶通过其外表面吸收养分。所以植物细胞诱导成胚从外部取得营养容易，不象动物要通过血液第四，器官发育的差别动物很早就开始器官发育，这些器官有高度特化的功能，然后靠血液循环系统、神经系统、脊髓、大脑、激素把各器官连成整体。并且动物器官的发育过程基本上只有一次，植物重复地产生器官而且是无限的。植物器官的发育是在生长区通过活细胞的活动，如顶端分生组织不断产生叶、芽、花，在这些具有活细胞的部位，可取活细胞进行移植和培养。由于动、植物在营养需要、代谢类型和发育方式上的不同，所以在器官形成上具有很大的差异。离体植物细胞具有潜在发育成植物体的能力。离体动物细胞（特化）在一定条件下，只能细胞分裂，而不能细胞分化和器官建成。与脱分化有关的因子及其作用1、损伤刺激 2、培养细胞的异质性 3、生长物质的影响 4、光线的影响1、损伤刺激-引起脱分化的第一个因子。 损伤首先导致外植体产生生化响应-细胞展现应激性这个基本属性。如气体交换率变化，呼吸速率增加（细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶增加）- 损伤呼吸2、培养细胞的异质性 不同外植体如茎、胚轴等各种已分化的细胞类型的复合体，细胞之间存在很大的异质性，对培养条件刺激有不同的敏感性。某类能够脱分化，其他则不能。 注意不同的倍数体和生理状态。3、生长物质的影响: 外源激素对脱分化起重要作用。 仅需加生长素即可诱导细胞分裂与生长，如菊苣； 仅需加细胞激动素类，如大豆、萝卜；另一类需加生长素和细胞分裂素类，如烟草髓、胡萝卜、马铃薯； 还有一类不需加任何激素，如冠瘿组织，烟草肿瘤组织。4、光线的影响光照下大量边缘细胞不分裂可能与还原氮的供应有关，细胞分裂和合成多酚物质产生对氮的竞争，可以通过添加氨基酸方法。导管分子的分化是离体条件研究细胞分化的模式系统。优点：易染色和标记，所以易发现、辨认、计量；处理条件和实验结果（导管分化情况）容易联系。微管组织的分化影响因素：(1)生长素和蔗糖浓度决定愈伤中维管束类型与数量实验： 将一块含有14C-IAA、蔗糖的琼胶楔形物插入到愈伤组织切口中，两者通过琼胶扩散到愈伤组织， 愈伤形成维管束瘤状物，瘤状物含有形成层带，一面形成韧皮部，一面形成木质部，与正常的维管束有类似的排列。类型 增加IAA浓度，导致木质部形成， 增加蔗糖浓度,导致韧皮部形成。数量 生长素水平恒定时（低浓度的生长素， 改变蔗糖浓度改变木质部、韧皮部的相对量）2%蔗糖则全部分化出木质部，4%蔗糖几乎全部分化出韧皮部， 3%蔗糖则可以分化出二者。（2）细胞分裂素类对促进木质部形成也有作用1）使碳水化合物代谢趋向于五碳糖途径，促进木质素前体苯丙烷的合成。2）不同种类作用不同：玉米素激动素6-BA（6-苄基腺嘌呤）3）木质分化对CTK需求似乎与培养物内源CTK的存在和多少有关。（豌豆必须）4）生长素/CTK的比值赤霉素（GA）、乙烯、脱落酸对木质部发生有抑制作用愈伤组织再分化的途径：器官建成和胚状体发生根和芽分化影响因素（1）植物激素的影响（调控模式） Skoog和Miller等所提出的生长素和激动素比例决定根和芽分化的观点，被大量试验证明。 同植物遗传性有密切关系； 也与激素种类（性质）、浓度、组合或称激素配比关系密切。比例比例高易于生芽高易于生芽低易于生根低易于生根比例比例高易于生芽高易于生芽低易于生根低易于生根细胞分裂素生长素（2）培养基的物理因素氧浓度（胡萝卜愈伤组织）降低 促进芽 增加 促进不定根。（3）外界条件-光质蓝光、紫光有利于芽的分化，红光、远红光对芽分化有抑制作用，但促进根分化胚状体是指在组织培养中从一个非合子细胞，通过合子胚相似的胚胎发生过程所形成的胚状结构。从胚状体可以形成完整的植株，这是植株细胞全能性的最强有力的一个证据。概念理解注意三个方面：1、与合子胚区别：胚状体起源非合子胚2、与无融合生殖胚区别：是组织培养的产物，只限于植物组织培养的范围内使用3、与组织培养中分化芽体的区别：胚状体的形成经历了胚胎发育的过程胚状体的特点胚状体是完整植株的雏形：a两极性：根端（类胚柄结构，可从外植体或愈伤组织吸收营养)和茎端 b与外植体的微管组织无直接联系胚状体发生方式a直接：外植体的表皮。亚表皮等。b间接：外植体到愈伤组织再到胚性细胞团最后到胚状体胚状体发生方式根据发生材料不同分6种1、外植体表面已分化的细胞进行垂周和平周分裂（表皮细胞起源的）；菟丝子原球胚的表皮细胞直接分化出直接胚状体、油茶子叶基部表皮细胞，胚轴、子叶茎等表皮发生二倍体。（直接）2、外植体内部的其他组织，周围(边缘细胞层)退化溶解，胚状体长大后突出于外植体的表面。芹菜。（直接）3、愈伤组织：液泡小、细胞质浓的小细胞，聚集为丛状胚胎发生丛。表面是高度分化的细胞团，一个胚胎发生丛可产生大量的胚状体。（常见、间接方式）4、单倍体胚胎发生：花药花粉和雌性器官培养中的单倍体胚状体。数量大，烟草一个花药产生200个。（直接或间接方式）5、悬浮细胞：（1）一个单个游离细胞发育，胡萝卜。（直接）（2）悬浮细胞生长分裂细胞团发育胚性细胞复合体表面胚状体。（间接）6、原生质体:玉米、黄瓜等的原生质体通过分裂。（直接）胚状体的发生方式根据发生的染色体体组不同分3种1、体细胞胚2、生殖细胞胚3、三倍体胚胚状体的发生过程（形态发生）1、细胞的不均等分裂在发生过程中起重要作用。 小细胞原胚组织球形胚鱼雷形胚子叶期胚；大细胞类似胚柄结构退化与合子胚并不完全相同，早期细胞分裂不一定遵循严格的顺序，有时缺乏典型的胚柄、子叶畸形（一片子叶不发育、多子叶）2、均等分裂如柑橘、紫苜蓿“预决定”观点：(了解) 离体胚胎发生是受内在的细胞间相互关系制约。单个细胞如果是处于胚胎决定状态，就可以独立地表达胚胎发生的潜能而发育成胚状体。胚胎决定状态的细胞如被其他细胞所包围，而这些细胞也处于同样的决定状态，那么这群细胞就可以共同作为胚性细胞，通过胚胎发育过程。无论是单细胞、多细胞起源，关键是培养的细胞是否为胚胎预决定细胞。影响胚状体的发生的外部因素1、培养基的激素成分：（1）可在无激素培养基上诱导出胚状体，如烟草、曼陀萝、水稻、柑橘、小麦花药培养；（2）先在生长素的培养基上诱导出胚性细胞团，然后转入低或无生长素培养继续发育胚状体。（3）在细胞分裂素培养基上诱导出胚状体。如大麦、檀香等。（4）需要生长素与细胞分裂素的一定比例诱导胚状体，如玉米、核桃、咖啡、油茶、酸枣、桃等。2、氮源有证明培养基中还原态氮（氨态氮NH4+）对胚状体有利，但我国使用的N培养基硝酸盐含量高，也有很好的作用。3、有机物水解酪蛋白或多种氨基酸对胚状体发生有促进效应。影响胚状体的发生的内部因素1、生理上的隔离： 细胞与周围组织之间在生理上的隔离是进行体细胞胚胎发生的先决条件。 胚状体原始细胞在开始分裂形成较清晰的细胞界限，边缘有较厚的细胞壁与周围细胞隔开。2、基因型的影响：同科如茄科；同物种不同品种如水稻、棉花。3、外植体的来源：少数植物所有器官， 多数植物的少数器官。4、培养细胞时间和细胞倍性变化一般：刚分离、诱导、经过短期培养容易产生，随着培养时间延长，发生的能力下降或丧失。也有的只有经过一定时间培养，才能产生胚状体。咖啡70天、檀香5次继代、人参8个月。5、胚状体发育成植株的能力：进一步发育需特殊条件；还有一部分不能发育，如胚乳形成的胚状体（蓖麻、桃等）。第5章 植物细胞工程的应用1增加遗传变异性，改良作物 1.1 单倍体育种：通过花药培养，从小孢子获得单倍体植株，染色体加倍后获得正常二倍体植株，这是一条育种的新途径。1.2胚培养、子房培养、胚珠培养：为了克服远缘杂交的不亲和性，可采用胚、子房、胚珠培养和试管受精等手段。1.3突变体的选择和应用：由于植物的单细胞培养成功，可以用这个方法诱发单细胞进行突变，通过筛选所需要的突变体，然后使细胞分化成植株，再通过有性世代使遗传性稳定下来，这是从细胞水平来改造植物的一种途径。除细胞外，愈伤组织、花药、原生质体都可诱发突变。1.4体细胞杂交和遗传工程1.4.1通过异种原生质体的相互融合（即体细胞杂交）为植物育种工作开辟新的途径1.4.2原生质体没有胞壁，容易接受外来的引入物质。如：农杆菌介导的转基因技术。2繁殖植物2.1组织培养中从一个单细胞，一块愈伤组织，一个芽（或其它器官）都可以获得无性系。2.2植物离体培养与脱除病毒3有用化合物的工业化生产利用组织培养方法，培养植物的某些器官或愈伤组织，并筛选出高产、高合成能力、生长快的细胞株系，以进行工业化生产，是一条行之有效的途径。4培养物低温贮藏和种质库的建立保存种质的传统方法是建立种质资源库（短期、中期、长期）来保存种子，目前国际上正在研究利用细胞工程技术保存一些营养繁殖尤其是一些濒危植物，建立基因库。4.1在液氮（-196）条件下，加入冷冻保护剂，可使组织培养物的代谢水平降低，有利于细胞、胚状体、试管苗、愈伤组织等的长期保存4.2利用植物组织培养结合低温抑制保存。4.3在国际上一个新的动向是人工种子的试验。 第6章 植物离体快速繁殖和脱毒培养单细胞.愈伤组织.芽（或其他器官）经组织培养得到无性系无性系: 用植物体细胞繁殖所获得的后代。 无性系快速繁殖途径1、无菌短枝型 2、不定芽增殖型 3、器官型 4、原球茎 5、器官发生型 6、胚状体发生型：（一）无菌短枝型（节培法或微型扦插法） 方法：材料剪成带一芽叶的单芽茎段，转入成苗培养基，一定时间可成苗，再剪成带一芽叶的单芽茎段，继代又可成苗。特点：一次成苗，遗传性稳定，过程简单，移栽易成活。意义：快速繁殖；探讨茎细胞的生理特点；进行育种上的筛选突变体的过程。（二）不定芽芽增殖型方法：选取已发育成熟的顶芽和腋芽，进行诱导形成不定芽，而成植株。 特点：取材限于具有顶端分生和次生组织的物种；在较短时间内即可获得植株。对保存珍贵优良树种或花卉品种是简易而有效的方法；芽变芽，遗传性稳定。（三）器官型 方法：从离体茎、花器、叶、鳞片等离体的母体组织诱导不定芽，再成植株。特点：遗传性稳定；有时可直接产生小植株，是与器官发生型相对而言，即未经愈伤阶段；如贝母、百合的鳞片等。（四）原球茎方法：细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。特点：繁殖速度快，是兰属植物有的繁殖方式。（五） 器官发生型方法：由外植体经脱分化，诱导愈伤组织再分化，器官发生形成植株。（经典的组织培养）特点：繁殖速度快，遗传性不稳定，易发生变异，可创造有益突变体。（六） 胚状体发生型方法：由外植体或愈伤组织通过胚状体途径，形成植株。特点：遗传性一致，有些植物（如胡萝卜）胚状体发生数量很大。一、无病毒苗木：是指不含该植物主要的危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现为阴性反应的苗木。无病毒苗培育的意义1. 去除病毒危害，提高作物品质与产量。2. 减少环境污染，有利于保护环境 栽培去病毒植物可减少药剂的使用。无病毒苗培育的方法（一）、茎尖培养脱毒1、依据：感染病毒植株的体内病毒的分布不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染程度越低，生长点(分生组织约0.1-1.0mm区域)则几乎不含或含病毒很少。2、原理 在植物体内，病毒易于通过微管系统移动，但分生组织中无此系统；病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞间连丝，但它的速度极慢，难以赶上活跃生长的茎尖。 活跃生长的茎尖分生组织代谢活性很高，致使病毒无法复制。 若植物体内存在病毒钝化系统，它在分生组织中比在任何其它区域都有更高的活性而钝化病毒，使分生组织不受浸染。 茎尖分生组织存在较高水平的内源生长素，可抑制病毒的增殖。3、方法（二）、其他途径脱毒（了解）1、茎尖微体嫁接脱毒木本植物茎尖培养难以生根形成植株。将实生苗砧木培育在培养基上，在从成年无病毒树上取茎尖，在枕木切断面上进行试管微体嫁接，可获得无毒苗。2、热处理脱毒依据和原理：病毒受热不稳定，不是杀死而是钝化，增殖缓慢或停止，失去侵染能力；物理效应加速细胞分裂，提高竞争力。方法：温汤浸渍法：切下的材料50；热风法：将生长的盆栽植物移入室内或生长箱。35-40。3、愈伤组织培养脱毒依据：受病毒侵染的组织形成的愈伤组织并非所以的细胞都均一一致地带有该病毒。原理：外植体中有抗病毒的细胞；发生了突变；复制速度赶不上细胞增殖速度。4、珠心组织培养脱毒依据和原理：珠心组织与微管组织没有直接联系。方法：珠心组织培养-胚培养。如柑橘-多胚植物-受精胚和珠心细胞形成的无性胚 五、脱毒苗的鉴定鉴定方法（一）直接鉴定法 （二）生物鉴定法（三）抗血清鉴定法（四）电子显微镜检查法 （一）直接鉴定法：直接观察植株茎叶有无某种病毒引起的可见症状。不准确、不可见症状。（二）生物鉴定法（指示植物法）1. 概念：利用病毒在其他植物（指示植物或鉴别寄主）上产生特定症状（枯斑和空斑）作为鉴别病毒存在与否和种类的方法。2. 局限性：它只能鉴定靠汁液传染的病毒。3. 适用：草本与木本植物4. 优点：灵敏、准确、可靠，操作方便。 5、鉴定方法摩擦法（汁液涂抹法）取培养植株叶片榨汁抹在指示植物叶片（涂有500-600目金刚砂） 轻轻摩擦浆汁侵入叶片表皮细胞但有不损害叶片观察病斑嫁接法 取培养植株的芽 嫁接在指示植物上 观察病斑（三）抗血清鉴定法1、原理：植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，是一种较好的抗原，给动物注射后会产生抗体，抗体存在于血清之中称抗血清。不同病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。 2、方法：抗原的制备 抗血清的采收，分离把稀释的抗血清与未知的病毒植物的汁液在小试管内混合根据沉淀反应来鉴定病毒种类（四）电子显微镜检查法病毒有一定的形态（ 球状、杆状、线状等）和大小（ 0.01-0.3um ）。采用电子显微镜（分辨率0.0001um）可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，并鉴定病毒的种类。优点：灵敏度高，能在植物粗提取液中定量测定病毒。第三节 组织培养快速繁殖中注意的问题（了解）一、遗传稳定性问题二、玻璃化问题三、褐变问题一、遗传稳定性问题-保持原种特性问题体细胞无性系变异（40-60%）。影响遗传稳定性因素1、基因型2、培养时间3、发生方式 二、玻璃化问题（一）玻璃化现象形态学：试管苗植株矮小肿胀，失绿；叶、幼梢呈水晶透明或半透明；叶水浸状，叶片皱缩、卷曲 、脆弱；解剖学：叶缺少角质层蜡纸，没有功能性气孔、不具有栅栏组织，仅有海绵组织（二）发生的原因和机理乙烯产生，引发其他激素质和量上的改变及酶类如PAL的变化，导致蛋白质、纤维素和木质素的合成障碍及降解，叶绿素分解导致黄化，逐渐形成玻璃化症状。光呼吸，减低了光合作用，同时阻碍乙醇酸的转化，加剧了乙醇酸对植物的毒害；木质素形成受阻，也增加玻璃化的产生。（三）预防措施1）增加培养基中琼脂的含量，减少水分的吸收;2）增加培养基中蔗糖的含量，降低培养基水势；3）减少培养基中氮素含量;4）采用通气性能良