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综述口服药物吸收模型 摘要:本综述总结了研究口服药物吸收的常用模型,介绍各模型的研究方法、特点和应用进展,为探索口服药物的吸收机制选择恰当的研究方法，同时为药物吸收的科学评价提供参考。关键词:口服药物;肠道吸收;细胞模型;灌流模型；人工生物膜;研究方法 口服给药是目前最常见的给药途径，口服药物相对更加的方便，快捷，患者也更加容易适应这种给药方式。对于口服药物来说,小肠是吸收的主要场所,因此药物的跨肠道表皮细胞渗透是产生药效的决定性环节。药物经过胃肠道上皮细胞的转运机制共有4种：被动转运、载体媒介转运、膜动转运和细胞旁路通道转运。药物的转运是一个非常复杂的过程，某个药物的转运形式可能是1种，也可能是多种。了解药物在体内吸收的机制、速度和程度，尤其对于口服生物利用度较低的药物，研究影响其吸收的因素，对于改善物的吸收性质，提高药物的临床疗效具有重要的意义。目前研究口服药物吸收的模型有细胞模型、动物实验模型和人工生物膜模型等。1细胞模型 近年来, 通过肠上皮细胞的培养来作为研究药物吸收、代谢机制的体外模型取得令人鼓舞的进展。细胞模型方法所需的药量少,药物分析方法简单、快速,温度可控,能模拟体内复杂的生理条件,已经被广泛地用于药物高通量筛选和指导先导化合物的合成。目前用于研究药物分子跨膜转运的细胞模型主要包括Caco-2、HT29和MDCK、LLC-PK1。1.1 Caco-2 细胞模型 Caco-2 细胞来自人的直肠癌, 其结构和生化作用类似于人小肠上皮细胞, 含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，是药动学研究中应用广泛的肠吸收模型。它的应用主要包括：研究药物在小肠的吸收、转运和代谢机制；研究口服药物吸收促进剂的机制和毒性；研究药物的相互作用；研究药物在小肠中的稳定性；用于新药通透性的高通量筛选；研究药物与食物的相互作用；在评价结构修饰药物吸收效果中的应用。 与正常成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现逆向分化不同, Caco-2 细胞在传统的细胞培养条件下, 生长在多孔的可渗透的聚酯(polycarbonate)膜上可达到融合并自发分化为肠上皮细胞, 形成连续的单层 , 这种性质可以维持恒定约20d。由于Caco-2 细胞性质类似小肠上皮细胞, 因此可在此段时间内进行药物的跨膜转运实验。 Caco-2细胞的培养条件已经很成熟，将Caco-2细胞接种于含DMEM的培养液中，将培养瓶在37，5C02的培养箱中培养，DMEM的培养液中含有10胎牛血清(FBS)、1L-谷氨酰胺、l非必需氨基酸以及抗生素(青霉素、链霉素、庆大霉素等)，常用的培养槽是Snapwell或transwell转运培养槽以及MilliceU培养槽，实验时一般将将1104一1105个细胞cm2接种于带有微孔的聚碳酸酯膜或聚乙烯膜上,21 d后细胞自发生长成为具有生物屏障性质的融合层，即可使用。 与其他复杂的吸收模型不同之处是:Caco-2 细胞模型没有很多不确定的变化因素, 且存在于小肠上皮中的各种转运系统、代谢酶如谷氨酰胺转肽酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶、葡糖醛酸酶、P450 细胞色素同工酶及糖、氨基酸、二肽、维生素B12等多种主动转运系统等都存在于Caco-2 细胞中。因此Caco-2 细胞模型可作为研究小肠表皮细胞药物转运和代谢的体外模型。但Caco-2 细胞也有一定的缺点, 如:缺少肠壁的粘液层;缺少细胞异质性(单一细胞构成);屏障特性与结肠上皮细胞类似, 而与小肠上皮细胞有一定差别。但大量的研究表明, Caco-2模型适用于新药开发的早期阶段, 用来研究药物的吸收过程，被认为是目前最好的体外吸收模型。由于Caco-2 吸收模型在一定程度上有较高的重现性, 而且可以在一定控制条件下对药物进行高通量筛选, 由此获得大量的关于药物结构和吸收之间关系的信息, 并总结了基本的规律, 这些规律反过来可以指导药物的筛选。 王素军等首次采用LC-MS 法对槐果碱(sophocarpine,SC)在Caco-2 细胞上的转运特征进行研究,发现SC 从BLAP 方向与APBL 方向的通透性差别不明显,平均表观通透系数Papp =3.159 10 -5 cms-1且受温度影响不明显,因此SC的转运表现为被动扩散。1.2 HT29 细胞模型 HT29 细胞系(the human colonicadenocarcinoma cell line)与Caco2 细胞一样来源于人结肠腺癌细胞,能高水平表达肠道营养物质的转运蛋白。置于含10%FBS 的McCoys 5a 培养基中培养(37 、= 5%CO2 )。Maresca 等用HT29 细胞模型研究发现:不同浓度的脱氧瓜蒌镰菌醇(deoxynivalenol,DON)能有选择性的调节肠道转运蛋白的活性,从而影响各种营养素(如:糖、氨基酸和脂类)的吸收。与Caco2 细胞不同的是,HT29H 和HT29MTX 细胞可以通过分泌黏液来模拟小肠的黏液层。但该细胞生长很缓慢且不能获得理想的模型评价指标(如单层细胞跨膜电阻值、甘露醇被动扩散的跨膜通量),因此为了更好地模拟人小肠环境,研究者通常将Caco2 和HT29H(或HT29MTX)共同培养。1.3 MDCK细胞模型 MDCK(MadinDarby canine kidney)细胞系是马丁达比犬肾上皮细胞，在半透膜培养时分化为带有刷状缘膜的柱状上皮并形成紧密连接，MDCK野生型细胞具有异质性，主要有MDCKI和MDCK2种，其中MDCKl是较致密的单细胞层，有较高的TEER值。将人的MDR1(multidrug resistance1)基因转染到MDCK 细胞中,可建立一个能大量表达p的MDCKMDR1 细胞系 ,采用双向转运实验法考察药物是否为P-gp 的底物或抑制剂,这在药物的前期研发过程中具有重要的意义。 与Caco2细胞相比，MDCK细胞具有较高的生长速度和较低的TEER值。lrvine等研究发现被动吸收的药物MDCK细胞的渗透率与药物的吸收程度具有相关性，MDCK细胞与Caco一2细胞具有相似的表观渗透系数(apparent permeability coefficient)1.4 LLCPK1 细胞模型 LLCPK1细胞系(the porcinekidneyepithelial cell line)来源于猪的近端肾小管上皮细胞。用含3%FBS 的Medium199 培养基中培养(37、5%CO2 ),约1周后可以生长成为带微绒毛的紧密连接的高极化的单层细胞。与MDCK 细胞模型相似,LLC-PK1 细胞表达的P-gp 少,故将人的MDR1 基因地转染到LLC-PK1细胞中亦可建立一个大量表达P-gp 的细胞系LLC-PK1/MDR1。Hoffman等用LLC-PK1/ MDR1 细胞模型进行奥司他韦(oseltamivir,OS)的跨膜转运实验,证明了其转运是可以饱和的,OS 为P-gp 的底物致使只有少量的OS 及其活性代谢产物能跨过血脑屏障进入到中枢神经系统。2.动物实验模型 口服药物吸收的动物实验模型法主要包括在体法、离体法和体内法3 种。2.1 在体法 在体法主要包括在体肠道灌流法，肠道血管灌流法和肠肝血管灌流法以及慢性在体肠道分离环法等，其中以在体肠道灌流法最为常用。在体肠道灌流法主要包括在体肠循环灌流和单向灌流法。肠道血管灌流法和肠肝血管灌流法操作复杂，技术难度较大。在体法的优点是能保证肠道神经以及内分泌输入的完好无损，同时也保证了血液和淋巴的正常供应。缺点是技术难度较大，干扰因素较多。2.1.1肠道单向灌流法(unidirectional perfusion) 将麻醉的大鼠开腹,对需要考察的部位两端插管后结扎,用生盐水将肠道内容物冲洗干净。用缓冲液平衡系统5 min后灌入药物溶液再平衡5 min,于不同的时间段从灌流液中取样计算表观渗透系数。由于在实验过程中水分的吸收会影响灌流液体积,因此用一种几乎不被吸收的标示物(如酚红)来标示灌流液体积的变化。在体单向灌流相对于下文提到的循环灌流,是采用较低流速,在较短时间内进行的,这样不仅可以减少灌流导致的肠黏膜损伤,还可以防止在实验过程中药物的化学降解。2.1.2 肠道循环灌流(circulatory perfusion) 按2.1.1的方法插管并冲净内容物后,将插管与蠕动泵的胶管相连,形成回路并开动蠕动泵。于不同时间段取样测定药物和标示物的质量浓度并补加相同体积的空白循环液,根据标示物质量浓度计算供试液体积,根据每一时间段药物质量浓度和供试液体积的变化计算肠循环液中的药物剩余量。张颖等利用紫外分光光度法和HPLC法，以在体肠循环灌流为模型，研究汉防己甲素的吸收机制，发现其吸收机制为被动扩散，符合一级动力学特征。2.1.3 肠血管灌流(vascularly perfused intestine) 在肠道灌流的基础上,插管于对一段肠管供血的肠系膜血管,或者插管于对整段小肠供血的肠系膜上动脉和肝门静脉,形成肠血管灌流模型。Andlauer 等利用这一模型研究了白藜芦醇(resveratrol)的吸收和代谢,实验结果显示白藜芦醇在肠道有良好吸收,被吸收的白藜芦醇大量地代谢转化为白藜芦醇葡萄糖醛酸苷,证明了该灌流模型可以作为评价药物肠道吸收和代谢的有效工具。该方法基于血液中药物的增加来计算药物被吸收到血管的量,而不是像肠灌流那样基于灌流肠管中药物的损失来计算药物的吸收,所以更能真实反映药物在小肠吸收的情况。2.1.4 肠肝血管灌流(vascularly perfused intestine-liver preparation) 上肠系膜动脉以及肝静脉插管进行循环灌流,胆管插管引流胆汁,幽门静脉插管作为取样用LC-MS分析样品。Hirayama 等研究表明:该模型和肠道血管灌流模型标本可在2 h 内仍具活性并保持稳定,但其主要缺点在于缺乏激素和神经控制,导致大量水分涌入肠腔。 该模型具有封闭性,避免了药物向全身分布与排泄,使受试药物的浓度约为相同条件下口服的上百甚至上千倍,因此受试药物需药剂量小。此方法在研究代谢产物的形成,研究药物及其代谢产物的肝肠循环,评价药物吸收和肝首过作用,具有良好的应用前景和潜力。2.2 离体法2.2.1分离肠黏膜法(isolated mucosa) 大鼠麻醉状态下开腹,在肠腔内插管,用生理盐水冲洗肠内容物,取出肠管置于pH 为7. 4 的Krebs-Henseleit 的缓冲液中,套在直径约为0. 3 0. 5 cm 的玻棒上,用解剖刀小心地刮掉上皮下层组织,制得分离肠黏膜并将其固定于扩散池上,用于测定药物透过上皮细胞的情况。该方法干扰因素少、快速准确,、精度高,适于进行吸收机理的研究。但黏膜的分离操作较困难,而且刮离过程中容易使黏膜被破坏。2.2.2 外翻囊法(everted gut sac) 麻醉动物,分离出小肠段并去掉肠系膜,用生理盐水或缓冲溶液冲洗干净,然后根据实验目的将所需肠段分割为若干小段,外翻使肠黏膜向外,结扎一端后灌注人工培养液再结扎另一端形成囊状,置于含药培养液中培养,根据囊内、外被测药物随时间的变化量来反映肠道对物质吸收状况 。董宇等利用肠外翻囊模型研究小檗碱和巴马汀的体外肠吸收特征,表明了二者在大鼠不同肠段均为线性吸收,符合零级吸收速率,吸收形式可能为被动吸收。外翻肠囊法的优点是操作简单易行，在肠外翻模型中测定的是药物从肠黏膜侧到浆膜侧的透过量，可直接反映药物在肠黏膜细胞层中的转运过程。但是组织活性较低是它的主要缺点，因此操作时间不宜过长，不适合研究转运速度较慢的物质。同时在实验前需要观察药物在肠营养液中的稳定性。2.3 体内法(in vivo) 体内法是指口服药物后采用色谱法、分光光度法等测定体内药量(或血药浓度)及尿中原形药物排泄总量,通过求算一系列药动学参数来推算药物的生物利用度和吸收程度。除此之外还有目前正越来越广泛地应用于生物技术药物的吸收研究的同位素示踪法(isotopic tracer method),它是指以放射性同位素作为示踪剂将其标记在药物分子上,使药物有别于内源性物质。通过HPLC 分离出原型药物,再用相应的仪器检测出原药的放射性,从而计算出药物的浓度,评价药物的吸收。3.人工生物膜模型 上皮细胞膜就是一种生物膜,药物的吸收过程实际上就是一个跨膜转运的过程。因此通过在体外模拟生物膜,可以对药物的吸收进行科学的预测和评价。人工生物膜模型主要有平行人造膜法和固定化人工膜色谱柱法。3.1平行人造膜法(parallel artificial membrane permeabilityassay,PAMPA) PAMPA 也称通透性测定法,通过测定化合物通过或保留于磷脂双分子层屏障的通透性系数来预测药物的吸收性能。其方法是:吸取溶解于十二烷的磷脂溶液10 L 加于96 孔滤板中的疏水膜上,10 min 内定量吸取待测样品液加入到膜上方作为给药池,膜另一侧加入空白磷酸盐缓冲液为接受池,将滤板置于振荡水浴锅内低速振摇后取接受池样品进行测试分析。KV 等 结合了PAMPA 和Caco-2 细胞模型2 种方法对沙氏菌蛋白酶(serratiopeptidase)纯品和其脂质体制剂进行体外吸收评价,发现该药物制成脂质体制剂后其渗透性得到提高,获得了更好的口服吸收效果。3.2 固定化人工膜色谱柱immobilized artificial membrane (IAM)columns1995 年Beigi 等首次采用凝胶作为载体,利用固定化的脂质体作为固定相模拟小肠上皮细胞来研究药物的被动吸收过程。后利用涂敷磷脂的硅胶作为固定相,大大提高了固定相的机械强度和稳定性。由于药物在模拟生物膜色谱柱上的保留值与药物的小肠吸收有较好的相关性,因而通过测定药物在色谱柱上的保留值的差别,就可以粗略的判断药物在体内可能的吸收状况。因此在药物研发前期,将化合物在该色谱行为中容量因子的值与体外消除半衰期结合起来可以判断化合物是否具有良好的口服吸收。4. 结语 大多数情况下使用单一的方法来研究药物的吸收是不够的,需要权衡各个方法的利弊,结合多种方法去优化评价药物吸收的模型,或者是在药物研发的不同阶段,应不同的模型来进行筛选评价,也是完全必要和可行的。了解药物在体内吸收的机制、速度和程度，在进行药物结构的改善、处方设计和工艺改善，临床用药的合理指导方面均有重要意义。参考文献（1）王素军，王广基, 李晓天2, 阮金秀, 张振清，LC-MS法测定槐果碱及其在Caco-2细胞上的转运特征，中国中药杂志，第32卷第1期2007年1月（2）关溯，陈孝，Caco-2细胞模型药物吸收研究的有效“工具”中国药理学通报. 2004(06)(3)刘瑶，曾苏，MDCK-MDR1细胞模型及其在药物透过研究中的应用进展药学学报. 2008, 43 (6) : 559 - 564（3）徐术，刘忠良，胡晋红，药物肠吸收的实验研究方法概述，中国药房. 2009(16)（4） 郭涛等 ，Caco-2细胞模型在药物动力学研究中的应用J. 中国药师. 2003(12)（5） 张颖，蒋学华汉防己甲素大鼠在体肠吸收机制研究J中草药，2007，38(2)：224228（6）王素军,王广基,李晓天,等. 氧化苦参碱大鼠肠道吸收机理及吸收部位的研究 J . 中国临床药理学与治疗学, 2005, 10(12) : 1326.（7） 李高,方超. 药物肠道吸收的生物学研究方法J. 中国药学杂志. 2002(10)（8） 吴一凡, 刘 晖, 倪京满，平行人工膜渗透模型及其应用进展，药学学报 2011, 46 (8): 890895（9） 王敏，齐云Caco-2细胞模型及其在药物吸收研究中的应用新进展中国药学杂志，2007，42(16)：12011204（10） 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