自来水中细菌含量的测定.doc

微生物综合性、设计性实验论文题目：自来水中细菌总数的测定自来水中细菌总数的测定姓名:* 指导老师：*（ 太原师范学院 生物系092班 ）实验时间：2011年11月3日实验地点：太原师范学院南校区实验楼微生物实验室【摘 要】 本实验应用平板菌落技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌种数仅是一种近似值。目前一般采。实验用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板，计数。按菌落计数方法进行计数，通过实验测得的菌数对照国家饮用水标准来判断水质。自来水的微生物学检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准（GB5749-85）规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。所谓细菌总数，指1毫升或1克检样中所含的细菌菌落的总数。水中细菌的数目也是判断水质的一个重要标准。本实验通过计算出水中的细菌总数，通过实验得到：乳白色菌落不规则的分布在培养皿上，经计数，取其平均值得到，菌落数为 71，经计算得1 mL自来水中细菌总数为28 ，符合我国饮用水的标准。【关键字】 自来水 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 平板菌落计数技术 乳白色菌落前 言水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含一定数量的微生物。水中微生物的主要来源是：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来自于人和动物的传染性排泄物。自来水指通过水处理厂净化、消毒后生产出来的符合国家饮用水标准的供人们生活、生产使用的水必须符合国家生活饮用水卫生标准1。细菌总数是指水样在一定条件下培养后（培养基成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等）所得1mL水样所含菌落的总数。本实验只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的细菌菌落总数。 本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数是用微生物测水质的常用方法。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。通过此方法我们能够计算出水中的细菌总数，从而判断自来水是否符合国家标准，是否受到污染。 实验用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板，计数。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。所谓细菌总数，指1毫升或1克检样中所含的细菌菌落的总数。按菌落计数方法进行计数，得到如下结果：在显微镜下可观察到众多的菌落且种类繁多，取其平均值得到，菌落数为 65/mL，自来水中细菌总数为65/mL，符合国家饮用水标准。一，仪器和材料 1.1 实验试剂 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠 、1mol/LNaOH溶液、1mol/L盐酸溶液、灭菌水 1.2 实验仪器 高压蒸气灭菌锅、带玻璃塞瓶、灭菌培养皿、灭菌三角烧瓶、天平、麻绳、量 筒pH试纸（pH5.59.0）、牛皮纸、试 管、牛角匙、棉花、记号笔、纱 布、吸 管玻璃棒、电热炉、称量杯二，试验方法2.1 水样的采取 先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再放开水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。2.2 固体培养基的制作2 牛肉膏蛋白胨培养基的配方3如下：牛肉膏 3.0 g蛋白胨 10.0 gNaCl 5.0 g水 1000mLpH 7.47.6将培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后到入烧杯。也可放在称量杯中，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。在上述烧杯中先假如少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，加入琼脂，再在石棉上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用PH试纸测其PH，直至PH达7.6。反之，用1mol/LHCL 进行调节。 2.3 高压蒸气灭菌2.3.1 将内层锅去除，再向外层锅中加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。2.3.2 放回内层锅，并加入要灭菌的培养皿、试管、烧杯等物品（注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果）。2.3.3 加盖，并将盖上的排气管插入内层的排气槽内，再2两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。2.3.4 本实验用0.1MPa，121.5，20min灭菌。灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。2.4 细菌总数的测定4 2.4.1 采样 用灭菌吸管吸取1mL水样，注入灭菌培养皿中，共做两个平板。 2.4.2 水样接种 分别倾注约15mL已溶化并冷却到45左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，并立即在桌上做平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。另取一空的灭菌培养皿，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照。 2.4.3 培养培养基凝固5后，倒置与37温箱中，培养24h，进行菌落记数。 2.4.4 计数两个平板的平均菌落数即为1mL水样的细菌总数。三，结果与分析3.1 实验数据与分析3.1.1 实验数据 表：自来水中菌落数表实验数据平板编号 菌落数/个 1ml自来水中细菌总数/个1 70 2 72 28对照组 43 3.1.2实验分析 根据表1中所得数据，我们可以计算出1 ml自来水中细菌的总数：两个平板菌落之和的平均数-对照组的菌落数，即（ 70 + 72）/ 2 43 = 28。因细菌是一个整体生物不存在小数，所以1 mL自来水中的细菌总数是24。根据国家卫生标准可饮用水中的细菌个数为每毫升100个，而此自来水中的细菌个数为28个，低于国家标准，故该自来水水质合格。对照组中的菌数应为43个，但实验测得数据为28个，这主要是因为有杂菌混入，杂菌来源可能：培养皿灭菌不充分；灭菌后在空气中放置又落入杂菌；培养基倾入培养皿后没有立即加盖；配置培养基时反复升降温（没有立即转移使培养基凝固），使一些杂菌产生抗性;做实验时灭菌后对着培养基呼气也可能造成细菌污染。所以在以后的试验中必须注意实验操作的严密性。由于培养基是倒置的，所以可以观察到绝大多数的细菌着生在培养基表面。这是由于菌种在固体培养基上借助重力作用而形成的，有利于菌落计数。倒置培养基时应降温至45 ，以免温度过高烫死大肠杆菌。切记不能过低，防止培养基凝固。倾注培养基后要将平皿在桌面上做匀速旋转，将培养基和自来水样摇匀，在培养基中观察时可见一些菌苔就是平皿没有摇匀的结果。3.2 菌落记数方法6 3.2.1. 先计算相同稀释度的平均菌落数，若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以为片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数7。3.2.2.首先选择平均菌落数在30300之间的，则只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的菌落总数。3.2.3.若有两个稀释度的平均菌落数均30300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。3.2.4. 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。3.2.5. 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。 3.2.6. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。四讨论 水是生命之源，水质的好坏对人们生活起着至关重要的作用，而判断水质的标准8，微生物在水中的数量、种类是必不可少的。细菌是微生物界的一个大类群，它与人类的生活密切相关，为了我们更好地生活，我们必须研究细菌，并掌握一些方法，来使细菌向人类有用的方面发展。自来水的微生物学检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。 通过此实验，我们可知平板菌落技术法是测定水样中细菌个数比较方便的方法，但它也存在一些无法避免的因素，比如在数菌落时，菌落太小且又处于培养基内部，这样就不能准确地观察到菌落，从而影响实验结果；又如在培养过程中由于细菌之间的相互抑制也会使菌落计数的结果减少。另外，在实验中应该注意以下几点：倒置培养基时应降温至45 ，以免温度过高烫死大肠杆菌，也不能过低，防止培养基凝固。倾注培养基后要将培养皿在桌面上做平面旋转摇动，将培养基和自来水样摇匀，在培养基中观察结果时可见一些菌苔就是培养皿没有摇匀的结果。五，总结细菌是微生物界的一个大类群，它与人类的生活密切相关9 ，其中有的有益，有的有害，为了我们更好的生活，我们必须研究细菌，并掌握一些方法，来使细菌向人类有用的方面发展。通过此实验，我们可知平板菌落技术法是测定水样中细菌个数比较方便的方法，但它也存在不准却的因素。水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求不同，不可能在同种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能很好的生长繁殖，又由于水中细菌在水体中能以单独个体、成对、链状，成簇或成团的形式存在10，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。又因在培养过程中由于细菌之间的相互抑制也会使计数菌落减少。因此，只有我们在不需要精确的情况下才可使用此方法。5. 注意事项 （1）倒置培养基时应降温至45 ，温度过高会烫死大肠杆菌，过低会使培养基凝固。（2）倾注培养基后要将平皿在桌面上做匀速旋转，将培养基和自来水样摇匀，在培养基中观察时可见一些菌苔就是平皿没有摇匀的结果。（3）培养基不能反复升降温，倾入培养皿后应立即加盖，且灭菌后不应在空气中放置，以免杂菌混入。（4）应在高温时给对照组中倒培养基，否则对照组中会出现大量的菌落。（5）在实验操作过程中操作者尽量避免对着培养基呼气。【参考文献】1 王子石 秦钰惠 郑乃彤 潘长庆 张明 生活饮用水卫生标准2007.7.12 沈萍 陈向东 微生物学实验（第四版） 高等教育出版社 20083 郝士海，现代细菌学培养基和生化试验手册北京：中国科学技术出版社，19924 沈萍 范秀容 李广武主编