毛细管气相色谱测定食品中的环己基氨基磺酸钠(修2).doc

毛细管气相色谱法测定食品中的环己基氨基磺酸钠宋家玉 焦艳妮 陈金东 周景洋 张宁 刘春娇（山东省疾病控制中心，济南，250014， 邮箱 ）摘要：建立了食品中环己基氨基磺酸钠的毛细管气相色谱检测方法。食品中的甜蜜素用水超声提取，酸性环境衍生化生成环己醇亚硝酸酯，庚烷萃取，分流不分流方式进样，用弱极性毛细柱程序升温分离，氢火焰离子化检测器检测，保留时间定性，外标法定量。甜蜜素浓度在0.011.0mg/mL范围内与峰面积线性相关，相关系数r=0.9996，质量检出限为1ng。 1.0 g/kg、 0.2g/kg和0.05 g/kg三水平添加量的回收率为84.7%103.4%，测定结果相对标准偏差为2.95%6.79%（n=5）。本方法经方法学考察具科学性和可操作性。关键词：环己基氨基磺酸钠食品 毛细管气相色谱法 环己基氨基磺酸钠 (甜蜜素)是一种人工合成的非营养型食品甜味剂（1），甜度约为蔗糖的30-50倍。在我国广泛用于蜜饯、饮料等食品中，如超量使用，会引起食品安全问题。因此，我国对食品中的甜蜜素添加有严格的限量标准（2，3）。我国食品中环己基氨基磺酸钠的测定方法为1991年首次发布（4），2003年标准GB/T 5009.97仅对标准的名称和标准的结构编写进行了修改（5），距今已有多年，在诸多方面不能适应现代食品安全的需要；为了保障消费者身体健康，建立灵敏度高、特异性好而又简便易行的分析方法是很有必要的；近年来，甜蜜素检测技术研究取得了重要进展（6-14），如毛细管气相色谱法、高效液相色谱法、离子色谱法、GC-MS法、LC-MS法等提高了甜蜜素的分析测试水平；修订原标准、提高方法的灵敏度、重现性、结果的准确性，不断增强标准的科学性和可操作性是该标准修订的主要目的和原则。为此我编制组接受卫生部食品安全综合协调与卫生监督局和食品安全国家标准审评委员会的委托，广泛征求意见，2010年10月底完成标准、文献资料收集整理工作，参照文献（6-14）确定标准研究的方法与技术路线；建立了修订标准第一法气相色谱法-毛细管气相色谱法和增加第二法液相色谱法替代回收率、灵敏度、重现性均低的薄层法、比色法、填充柱气相色谱法；并对样品处理和仪器使用条件进行优化，开展方法重现性、灵敏度、检出限、分离度、准确度、线形关系等技术内容确定研究。用此方法对2010年10月至12月间部分食品进行了环己基氨基磺酸钠分析验证。2011年5月中旬完成标准方法征求意见稿，现将建立的修订标准第一法气相色谱法-毛细管气相色谱法介绍如下：1实验部分1.1 主要仪器、试剂和材料1.1.1主要仪器气相色谱仪：CP-3800型包括氢火焰离子化检测器、STAR V6.2工作站，美国VARIAN公司； 超声波清洗仪：AS3120A型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司； 高速均质器：IKA-T 18BS,德国IKA公司；离心机：转速4000 r/min。上海医疗器械手术离心机厂。1.1.2 试剂和材料正庚烷经重蒸、气相色谱确认符合检测的要求；氢氧化钠、亚铁氰化钾（K4Fe(CN)63H2O）、硫酸锌（ZnSO47H2O）、亚硝酸钠、浓硫酸、无水硫酸钠和氯化钠均为分析纯。石油醚：沸程为30-60。环己基氨基磺酸钠标准品：含量99%，美国SUPELCO公司产品 。水为GB/T6682规定的二级水。实验样品：系2010年本实验室采集的部分食品 30份。1.1.3 试剂配制 氢氧化钠溶液（40g/L）：称取20 g氢氧化钠，溶于水并稀释至500 mL。硫酸溶液（200g/L）：称取100 g硫酸小心加入400 mL水中，后加水至500 mL。亚铁氰化钾溶液（150g/L）：称取15g亚铁氰化钾，溶于水并稀释至100 mL。硫酸锌溶液（300 g/L）：称取30 g硫酸锌，溶于水并稀释至100 mL。 亚硝酸钠溶液（50g/L）：称取25 g亚硝酸钠，溶于水并稀释至500 mL。 1.1.4 环己基氨基磺酸钠标准溶液配制 环己基氨基磺酸钠标准储备液（5.00mg/mL）：精确称取环己基氨基磺酸钠标准品，用水溶解并定容至浓度为5.00mg/mL ，置于1-4冰箱保存，可保存两个月。 环己基氨基磺酸钠标准使用液（0.50mg/mL）：用水将10.0 mL环己基氨基磺酸钠标准储备液稀释定容至100mL；临用时配制。1.2实验方法1.2.1试样制备液体试样处理一般液体试样摇匀后可直接取样。含二氧化碳的试样：称取50.0g试样于烧杯中，放置电热板上加热以除二氧化碳，待除尽后，放冷，用水补足至50.0g制成试样备用。含酒精的试样：称取50.0g试样于烧杯中，用氢氧化钠溶液调至碱性，放置电热板上加热以除酒精，待除尽后，放冷，用水补足至50.0g制成试样备用。固体、半固体试样处理凉果、蜜饯类等固体试样先将其去核，坚果和籽类等先将其去壳，固体样品置于粉碎机打碎、均质，将粉碎好的样品放入食品保鲜袋中，待取样用。冰棒、雪糕、冰淇淋等分别放置于250 mL烧杯中，待融化后搅匀可直接称取。固体、半固体试样根据基质的不同按下列步骤进行处理：A 低脂、低蛋白样品（果酱、果肉、山楂饼、蜜饯、凉果、浓缩的果汁、果粒汁、甜点、酱菜、咸菜等）称取5.00g-10.00g样品于50 mL离心管中， 加40 mL水 ，振摇，超声提取20 min ，混匀，离心（2000 r/min ）10 min，过滤，用水分次洗涤残渣，收集滤液并定容至100 mL，混匀备用。B 高蛋白样品（酸乳、果冻、雪糕、冰激凌等奶制品及豆制品、腐乳等）称取5.00g-10.00 g样品于50mL离心管中， 加40 mL水 ，超声提取20 min ，加3 mL亚铁氰化钾溶液，混匀，再加入3 mL硫酸锌溶液，混匀,离心（2000 r/min）10 min，过滤，用水分次洗涤残渣，收集滤液并定容至100 mL，混匀备用。C 高脂样品（奶油制品、坚果和籽类等）称取 5.00g-10.00 g样品于50 mL离心管中，加入25 mL石油醚，振摇，超声提取3 min ，再混匀，离心（1000 r/ min以上）10 min，弃石油醚，再用25 mL石油醚提取一次，弃石油醚，60 水浴挥发去除石油醚，残渣加40 mL水 ，混匀，超声提取20min，加3 mL亚铁氰化钾溶液，混匀，再加入3 mL硫酸锌溶液，混匀，离心（2000 r/min）10min，过滤，用水洗涤残渣，收集滤液并定容至100 mL，混匀备用。试样溶液的制备液体试样（）直接称取2.00g-10.00 g于50 mL带盖的离心管中，易乳化或浓度高试样可减小取样量并加水至10 mL。固体、半固体试样移取上述已处理好的样液（）10.0 mL于50 mL带盖离心管中。以备衍生化用。1.2.2标准溶液系列的制备准确移取0.50 mg/mL环己基氨基磺酸钠标准使用溶液0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、10.0 mL于50 mL带盖离心管中，加水至10 mL。配成衍生化后进样液浓度相当于0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.25mg/mL、0.50 mg/mL、1.0mg/mL的标准溶液系列。 1.2.3试样溶液及标准系列溶液的衍生化把上述装有标准系列溶液（1.2.2）和试样溶液（）的离心管放置在试管架上，置冰浴中，加入2.5 mL 亚硝酸钠溶液，2.5 mL 硫酸溶液，盖紧离心管盖，摇匀，在冰浴中放置30 min，其间振摇3-5次；后准确加入5.0 mL正庚烷，2.5 g氯化钠，盖上盖后置旋涡混合器上振动1 min(或振摇60-80次)，离心（3000 r/min）10min分层或静置20 min至澄清分层后取上清液以备进样用。1.2.4测定色谱参考条件a)色谱柱: HP-5型毛细柱（30 m0.32 mm，0.25 m，美国Agilent Technologies公司）；b)柱温升温程序：初温60保持2 min，10 /min升温至90 保持0.5 min，20 /min升温至220 保持3 min。c)进样口：温度230 ；进样量1 L，分流不分流进样 ，分流比110(分流不分流、分流比可根据色谱条件调整）。d)检测器：氢火焰离子化检测器（FID），温度260。e)载气：高纯氮气，流量2.0 mL/min，尾吹30 mL/min。f)氢气：30 mL/min；空气330 mL/min（载气、氢气、空气流量大小可据仪器条件进行调整）。色谱分析分别吸取1 L衍生化处理的标准系列各浓度溶液（1.2.3），注入气相色谱仪中，可测得不同浓度被测物的响应值峰面积或峰高，以浓度为横坐标，相应的峰面积值或峰高值为纵坐标，绘制标准曲线。同样进样1 L衍生化处理的试样待测液（1.2.3），保留时间定性，测得峰面积或峰高，根据标准曲线得到进样液中的组分浓度；试样待测液响应值若超出线性范围，应用正庚烷稀释后再进样分析。平行测定次数不少于两次。1.2.5分析结果的表述 试样中环己基氨基磺酸钠含量按式（1）计算： X1=(1)式中：X1试样中环己基氨基磺酸钠的含量，单位为克每千克(g/kg)；C由标准曲线计算出进样液中环己基氨基磺酸钠的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；m试样质量，单位为克(g) ；5正庚烷加入量，单位为毫升(mL) ；待测液稀释倍数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。注：环己基氨基磺酸钠与环己基氨基磺酸的换算系数为0.8909。1.2.6方法的精密度和准确度试验采用标准添加法分别进行回收率实验，取适量已知浓度或阴性样品加标高中低浓度至0.05 g/kg、0.2 g/kg和0.5 g/kg、1.0 g/kg等水平，混匀后称取5 g左右，按1.2.1提取、1.2.3衍生化、1.2.4测定,每个水平测定5次, 计算回收率。精密度试验：取适量已知浓度或阴性样品捣碎加标配成高中低浓度为0.05 g/kg、0.2 g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg样品，混匀后取5g左右，按1.2.1提取、1.2.3衍生化，按1.2.4条件测定。计算精密度（n=5）。2结果与讨论2.1 色谱图图1 环己基氨基磺酸钠标准溶液衍生化处理后的气相色谱图（0.50mg/mL）图2 检出环己基氨基磺酸钠试样芒果汁衍生后的气相色谱图（0.26g/kg）环己基氨基磺酸钠标准品色谱图、检出环己基氨基磺酸钠残留样品色谱图分别见图1、图2。组分峰保留时间为5.9 min。与原标准使用填充柱相比较，克服了溶剂拖尾的干扰，分离度可满足要求，可解决环己基氨基磺酸钠与杂质用填充柱难以分离的问题。2.2 标准曲线与检出限毛细管柱测定标准系列在0.011.0mg/mL范围内浓度和峰面积呈线形关系见图3。r=0.9996显示线性关系良好。图3 环己基氨基磺酸钠标准曲线检出限：以3倍基线噪音（S/N=3）确定该方法质量检出限1ng, 检出限浓度0.001g/mL。 以液体取样量10g，加正庚烷5mL，进样1L时，确定方法检出限(LOD)0.5mg/kg, 以10倍基线噪音信号确定方法定量限(LOQ)1.7mg/kg。固体取样量10g，样液定容体积100mL，取10 mL衍生化，加正庚烷5 mL，进样1L时，方法最低检出限5mg/kg, 方法定量限17mg/kg 即0.017g/kg原标准填充柱法检出限0.04ug、100mg/kg。对含量较低或允许添加量较低特别是含量在mg/kg级的样品不能满足分析需要。毛细管柱测定灵敏度显著提高，可满足低含量样品的测定。2.3方法的精密度和准确度试验 将标准样分别加入高、中、低三水平浓度到液体果醋、固体样品山楂卷、奶油冰激凌中进行方法精密度和准确度试验，具体结果见表1。表1 液体 、固体试样的方法回收率及精密度（n=5）样品名称添加浓度(g/kg)回收率范围（%）精密度RSD（%）液体试样苹果醋0.54389.11690.297.65.550.04687.3101.46.79固体试样山楂卷1.0190.3 96.74.450.61390.799.33.040.11586.996.55.92固体试样奶油冰激凌0.93089.799.02.950.23084.7 94.96.510.05685.3102.36.73液体 、固体试样添加回收率在84.7%103.4%之间，相对标准偏差在2.95%6.79%。可满足分析要求。2.4 新标准与原标准主要变动2.4.1增加毛细管柱分析测定条件 本研究参照文献（6，10，12，13，14）的技术特点，利用实验室通用柱弱极性毛细管柱HP-5与国家标准（4，5）使用的填充柱相比分离效率、排除杂质干扰能力明显提高,能满足检测食品环己基氨基磺酸钠的分析要求。原标准GB /T5009.97 - 2003 中的气相色谱法采用填充柱分析，溶剂峰干扰大、分离效果差、准确性差、灵敏度低（质量检出限0.04g, 检出浓度大于100mg/kg)，对含量较低的样品不能满足需要。增加国内外较流行的分离度高、灵敏度高的毛细管色谱法，色谱图见图1、图2、保留时间5.95min，出峰快，与其他组分有效分离，峰形尖锐、分离效率高，灵敏度提高、以3倍基线噪音信号（S/N=3）确定质量检出限1ng ，回收率、精密度高，结果令人满意。2.4.2样品处理、净化方法进行优化处理原标准（5，4）固体样品处理方法单一，对复杂基质的样品缺少去干扰措施；研钵研磨法、振动提取，操作麻烦、费时。硅胶或海沙加入量不明确，且引入的这些固体物质占去了一定的体积，使定容后的体积不能真正代表稀释体积，导致准确度低；新标准使用机器打碎法、超声水浴震荡提取20 min、离心明显优于研磨法，具有快速，均匀等优点。参照欧盟标准（10）普通低蛋白、低脂固体食品经超声水浴20 min震荡提取、离心可满足分析要求。高蛋白样品由于基质中的蛋白质可能会把甜蜜素键合或包裹起来，直接用溶剂提取时难以把甜蜜素充分提取出来，且加入提取剂后较难分层而使操作无法进行下去，先加入蛋白沉淀剂亚铁氰化钾和硫酸锌使蛋白变性沉淀后再衍生化处理，效果理想，并且不会对甜蜜素造成损失，两者的用量分别为2-5.0mL时已能满足要求。高脂固体食品直接酯化后会有大量的杂峰产生，杂质严重干扰甜蜜素的提取、分离、分析。将样品预先用石油醚20mL提取12次去除脂质，再超声提取，效果理想。 液体试样：摇匀后直接取样。含二氧化碳、酒精的试样：称取50g的试样，加热以除二氧化碳、酒精，待除尽后，放冷，用水补足至50g，以备称取用，使方法操作更合理、准确。液体 、固体试样的方法回收率及精密度均可满足分析要求。本标准气相色谱法适用于饮料、凉果、配制酒、果酱、糕点、酱菜、冰淇淋、雪糕、果冻、调味料、咸菜、腐乳等食品中环己基氨基磺酸钠的测定。2.4.3 将原标准（5，4）单管标准衍生处理、分体积进样、定量分析修改为标准系列衍生处理、进样1L定量分析定量法；原标准采用单标准管、不同进样体积法制作标准曲线，偶然误差几率增大，GB/T 5009.97-2003中 “6.2.1中采用单个标准管酯化、萃取，然后分别进样1 5L，根据相应值对甜蜜素质量绘制标准曲线。改为准确吸取0.5mg/mL环己基氨基磺酸钠标准使用溶液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.5mL、5.0mL、10.0mL于50mL 带盖离心管中，加水至10mL，后进行衍生化，固定进样体积1L。理由：标准曲线的一个重要功能就是消除误差，特别是偶然误差的影响，显然GB/T 5009.97-2003采用单管制作标准曲线有违这个原则；另外，不同体积法进样易受进样针的准确性、仪器性能稳定性等因素的影响，且大体积进样，对毛细柱存在严重过载的问题。鉴于上述原因，采用多个标准管衍生化、固定体积1L进样，制作标准曲线更为合理。精密度、准确性提高，结果见表1、图3。2.4.4 萃取液正己烷改用正庚烷 原标准使用正己烷为萃取液，正己烷的沸点为68.7，在实验过程中容易挥发损失，造成检测结果偏离。另从保障实验操作人员身体健康的角度考虑，正庚烷的化学性质与正己烷相近，毒性远比正己烷低，且沸点为98.4挥发性低，参照欧盟标准（10）文献（6）采用正庚烷作为萃取液进行测定，结果无明显差异，精密度提高。2.5方法应用从市场采集30份样品包括苹果醋、芒果汁、桃汁饮料、橙汁、杏仁露、花生牛奶、果冻、山楂卷、杏肉、西梅、果丹皮、榨菜、腐乳、奶油冰激凌、海鱼罐头等，用修订后毛细管柱气相色谱测定方法对30份样品与液相色谱法进行对比检验，结果见表2，测出量平均数、最大值、最小值分别为0.841g/kg、2.92g/kg、0.007g/kg。对比检验结果无显著性差异。表2部分食品环己基氨基磺酸钠含量检测结果样品总份数检出份数检出范围mgkg-1阳性样品平均量mgkg-1GC30270.0072.920.841HPLC30270.0062.790.8063 结语 对标准第一法气相色谱法进行修订，试样处理、提取条件进行分类优化，解决了高脂、高蛋白试样易乳化、干扰等样品处理困难；增加毛细管柱分析测定条件，分离效率高、灵敏度提高，标准系列浓度在0.011.0mg/mL范围内具良好线形关系，r=0.9996。方法质量检出限1ng，加样回收率在84.7%103.4%之间，相对标准偏差在2.95%6.79%，可满足分析要求。修订后气相色谱法体现了方法的科学性、可操作性。基于上述理由提出修订后的食品中环己基氨基磺酸钠的测定第一法-气相色谱法。参考文献1 GB 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Center for Disease Control and Prevention， Jinan250014， China）ABSTRACT:The Sodium cyclamate in food was determined by capillary gas chromatography. The Sodium cyclamate in sample was extracted by ultrasonication ultrasonic bath with water，Derivatization byNaNO2 and H2SO4, extracted with n-heptxane supernatant was extracted by centrifugation and injected with split/splitless mode. The capillary column was HP-5 with programmed increasing temperature. finallywas separated by HP - 5 cap illary gas chromatography. The Sodium cyclamate was detected with hydrogen flames ion detector and calculated by external standard method. The peak area was linear with the concentration of Sodium cyclamate in the range of 0.011.0mg/mL,r=0.9996, The mass detection limit was 1ng, The recovery was 84.7%103.4% and the RSD was 2.95%6.79% less than 10%， This method is easy in operation and good at separation and repeatability.KEY WORDS: Sodium cyclamate Food, Capillary gas chromatographyMod if ica tion of detection of cyclama te in solid food by cap illary ga s chroma tography. ZHENG San - yan, L INShao - mei, L IANG xiao - rong, et al. (WenzhouMunicipal Center forDisease Control and Prevention, Wenzhou 325000,Zhejiang, P. R. China)Abstract:ObjectiveTo develop a method for determination of cyclamate in solid food by cap illary gas chromatography.MethodsThe cyclamate in the solid food was treated by p recip itation in the using of the reagents carrez1 and carrez2, and supernatant was extracted by centrifugation, then was derivated byNaNO2 and H2SO4, finallywas separated by HP - 5 cap illary gas chromatography. ResultsItwas showed that cyclamate contentwas in a good linear relation ( r = 0. 9997) with the range from 0. 254. 0mg/ml, the recovery rate was 96. 0% 101% , RSD was 1. 6%. ConclusionThismethod is simple, rapid, accurate and suitable for determination of wholesome sample.Key words: Precipitation; Cap illary gas chromatography; Cyclamate; Solid foodDeterm ina tion of sod ium cyclama te in foods by cap illary p illar (Liyang Center forDisease Control and Prevention, L iyang 213300, China) Abstract Objective: Some food compositi