Nisin产生菌的筛选及鉴定.pdf

第 4 8 卷第 7期 2 0 0 9年 7月 湖 北 农 业 科 学 Hu b e i Ag r i c u l t u r a l S c i e n c e s Vo 1 4 8 No 7 J u 1 2 0 0 9 N i s i n产生菌的筛选及鉴定 彭其安 王布匀 蒋 磊 程 勋 武汉科技学院环境与城建学院 武汉4 3 0 0 7 3 摘要 从新鲜牛奶样 品中用 M1 7 G筛选培 养基 定向筛选 出 2 0株 目的菌株 应用琼脂扩散 法 以黄 色微球 菌 Mi c r o c o c c u s 2 倒 NC B I 8 1 6 6为 指 示 菌 对 其 发 酵 产 物进 行 效 价 测 定 经 反 复 筛选 获 得 1株 稳 定 的 高产菌株 K Y 0 8 产 N i s i n效价为 8 1 3 I U m L 用细菌鉴 定系统 V i t e k 一 3 2进行 生化特征鉴定 并参照 了 伯杰 氏细菌学鉴定手册 第八版 将 K Y 0 8茵株初 步鉴定 为乳酸链球菌种的一个亚种 关键 词 Ni s i n产 生 菌 筛选 鉴 定 中图分类号 Q 9 3 3 3 l 文献标识码 A 文章编号 0 4 3 9 8 1 1 4 2 0 0 9 0 7 1 6 1 9 0 2 S c r e e ni ng a n d I d e n t i fic a t i o n o f Ni s i n pr 0 du c i ng S t r a i n P E NG Qi a n WAN G B u y u n J I ANG L e i C HE NG X u n S c h o o l o f E n v i r o n m e n t U r b a n C o n s t r u c t i o n Wu h a n U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d E n g i n e e r i n g Wu h a n 4 3 0 0 7 3 C h i n a Ab s t r a c t Mo r e t ha n 2 0 s t r a i n s we r e s e r e e n ed b y f r e s h mi l k s a mp l es o n M 1 7G c u l t ur e me d i u m The a n t i mi c r o b i a l a c t i v i t i e s o f t h e i r f e r me n t a t i o n p r o d u c t s w e r e t e s t e d b y t h e a g a r d i f f u s i o n me t h o d u s i n g Mi c r o c o c c u s fl us N C B I 8 1 6 6 a s a n i n d i c a t i n g s t r a i n On e s t a b l e a n d h i g h y i e l d s t r a i n w a s o b t a i n e d a n d n a me d a s K Y0 8 I t s p r o d u c t i o n wa s u p t o 8 1 3 I U mL Ac c o r d i n g t o t h e r e s u l t s o f a u t o ma t e d mi c r o b i o l o g i c a l a n a l y s i s i n s t r u me n t Vi t e k 一 3 2 a n d B e r g e s Ba c t e r i o l o g y t h e e i g h t h e d i t i o n KY0 8 wa s t e n t a t i v e l y i de n t i fie d a s a s u bs p e ci e s o f S t r e pt o c o c c us l a c t is Ke y wo r d s N i s i n p r o d n e i n g s t r a i n s c r e e n i n g i d e n t i fi c a t i o n 乳 酸 链 球 菌 素 N i s i n 是某 些 乳 酸 链 球 菌 产 生 的具有 3 4个氨基酸残基的多肽类物质 对引起食 品腐败的大多数革兰氏阳性菌有很好的抑制作用 属于高效 无毒副作用 的天然生物防腐剂 本文根 据 N i s i n产生菌 中 N i s i n编码基 因和蔗糖发酵基 因 紧密 连 锁 的原 理 在 添 加 N i s i n 蔗 糖及 溴 甲酚 紫 的 M1 7 G选择 培养 基 上 从 新 鲜牛 奶样 品中快 速 准 确 地筛选 出 目的菌株 并进行 了复筛 稳定性考察和 生理生 化特 征鉴 定 1 材料与方法 1 1 材 料 1 分离样品的来源 未消毒鲜牛奶 采 自徐州 市上坝村奶牛养殖基地 2 菌 种 黄 色 微 球 菌 Mi c F O C O C C 7 o u s N C B I 8 1 6 6 本 实验 室保 藏 3 主要培 养基 乳 酸乳 球菌 试管 斜 面 平 板 分离 液体种子及增殖培养基均选用 M1 7 G培养 基 筛选培养基 M1 7 G培养基添加 0 0 0 4 溴甲酚 紫 和 5 0 I U m L 的 N i s i n 发 酵 培 养 基 采 用 C M 培 养基 效价测定培养基 采用 S I 培养基 4 主要 试剂 及仪 器 N i s i n标 准品 浙江 银象 生 物 工 程有 限公 司 V i t e k 一 3 2细菌 鉴 定 系统 法 国生 物 梅里 埃公 司 1 2方 法 1 2 1 N i s i n产 生 菌 的 筛选将 新 鲜 牛奶 样 品接 种 于含 5 0 I U mL N i s i n的 M1 7 G液体增殖培养基 中 稀释涂布于选择培养基上 3 0 恒温培养 2 4 4 8 h 对培养后能使周 围紫色培养基变黄 的单菌落编号 保藏 将初筛菌接人发酵培养基中 摇瓶发酵测定 其效价 并将复筛菌转接 摇瓶发酵 对产 N i s i n效 价较高 稳定的菌株进行鉴定 1 2 2 菌种鉴定 将 目的菌株平皿划线 活化 1 2 h 后 观 察 单 菌落 形 态 镜 检 后 进 行 接 触 酶试 验 和革 兰氏染色 挑取单菌落用 V i t e k 一 3 2鉴定系统进行生 化鉴定 参照文献 4 的参数进行分析 收稿 日期 2 0 0 9 0 2 2 6 作者简介 彭其安 1 9 8 1 一 男 湖北潜江人 助教 硕士 电话 1 3 2 9 7 9 7 6 7 6 5 电子信箱 p q a 2 0 0 2 一 1 6 3 c o m l 6 2 0 湖 北 农 业 科 学 2 0 0 9正 2 结果与分析 2 1 初 筛结 果 经过初筛 从新鲜牛奶样品中共筛选出 2 0株 菌株 即能在筛选培养基上生长 颜色由紫 色变黄 色的菌落 其余为杂菌 图 1 对其进行命名 K Y O 1 K Y 2 0 初 筛后 摇瓶 发酵 效价 见 表 1 由表 1可知 K Y 0 6 K Y 0 8 K Y1 5效价 较高 均超 过 8 0 0 I U m L 为 3株乳酸链球素高产菌 图 1 初筛菌落 表 1 初 筛 菌株 发 酵 产 物效 价 菌株 效价 菌株 效价 菌株 效价 编 号 I U m 编 号 I U mL 编 号 1 U mL KY0 1 6 6 3 KY0 8 8 2 2 KY1 5 8l 2 KYO 2 3 7l KY0 9 5 5 2 KY1 6 7 4 0 KY0 3 2 8 3 KYl 0 6 7 7 KY1 7 6 9 0 KY 0 4 4 5 3 KYl 1 7 9 l KY1 8 3 8 6 KY 0 5 7 7 2 KY1 2 2 9 8 KY1 9 7 5 8 K Y 6 8 02 KY1 3 5 6 6 KY2 O 5 0 5 KY0 7 7 8 6 KY1 4 41 4 2 2 复筛及 稳定 陛考察结 果 将 复筛 到 的 K Y 0 6 K Y 0 8 K Y1 5菌株 分别 转 接 至第五代 分别命名为 K Y 0 6 1 K Y 0 6 5 K Y 0 8 1 K Y 0 8 5 K Y 1 5 1 K Y1 5 5 摇 瓶发 酵后 测定 效价 考 察其稳定性 结果 见表 2 通过 分析 比较 K Y 0 8菌 株 的效价最 高且 相对稳定 平均效价 为 8 1 3 I U m L 表 2复筛 菌 株效 价 菌株 效价 菌株 效价 菌株 效价 编 号 I U m1 编 号 I U m L 编 号 I U m L KY0 6 1 8 2 5 KYO8 一l 8 4 2 KY1 5 1 7 9 1 K Y0 6 2 7 9 0 KY08 2 8 2 2 KYl 5 2 8 2 6 KY0 6 3 7 63 KY08 3 8 1 4 KYl 5 3 7 7 6 K Y0 6 4 71 2 KYO8 4 8 0 3 KYl 5 4 6 9 3 KY0 6 5 6 5 4 KY0 8 5 7 8 6 KY1 5 5 5 4 8 2 3 菌种鉴 定结果 2 3 1 K Y 0 8菌株 的 细 菌学鉴 定在 M1 7 G培养 基 上 活化 1 d 后 K Y 0 8长出 的菌落 0 8 1 2 m m 乳 白 色 圆形 隆 起 较 光滑 湿润 边 缘 整 齐 在 显 微 镜 下 观察 图 2 细胞 卵 球 型 直 径 为 0 7 1 5 m 沿 链 长轴方 向生 长 每条链 上有 2 2 O个细 胞 接触 酶 图 2细菌 显 微 照相 6 4 0 x 试 验呈 阴性 革 兰 氏染 色 阳性 无芽孢 不运 动 2 3 2 菌 种 生 化 鉴 定 使 用 微 生 物 鉴 定 系 统 V i t e k 一 3 2的革 兰 氏 阳性 菌 鉴 定 卡 G P I 对 K Y 0 8进 行鉴 定 鉴 定结果 如表 3 表 3 Vi t e k 一 3 2 GPI鉴定 卡 鉴 定 结果 特征反应 结果 特征反应 结果 P B 蛋白胨基质 S A L 水杨 素 H C S f 半纤维素酶 T R Ef 海藻糖 4 0 Bf 4 0 胆汁 一 P UL f 支链 淀粉 一 U R E r 尿素 一 ML Zf 松i糖 一 D E Xf 葡萄糖 X YL f 木糖 一 R AF f 棉子糖 一 0 P T 奥普托琴 S UC f 蔗糖 1 O Bf 1 O 胆 汁 P YR 丙酮酸 一 A R G 精氨酸 一 ME L f 蜜二糖 一 N O V 新生霉素 一 R I B f 核糖 1 一 MA N 甘露醇 一 B A C f 杆菌肽 一 S O Rf 山梨醇 一 6 N C f 6 氯化钠 一 AR A 阿拉伯糖 一 E S C f 七叶灵 I N Uf 菊糖 一 T Z Rf 红 四氮唑 一 C E L f 纤维二糖 L A Cf 乳糖 C A q 氯霉素 乙酰转移酶 一 注 为阳性反应 一 为阴性反应 3 小 结 本 实验 室筛选 出 的菌株 K Y 0 8细胞直 径 比相 关 资料记载值 0 5 1 0 m稍大 可利用蛋 白胨 葡萄 糖 蔗 糖 乳 糖 纤 维二 糖 奥普 托琴 七 叶灵 不利 用棉子糖 菊糖 山梨醇 在含 6 的 N a C 1 或 4 0 胆 汁培养基 中不生长 不能水解精氨酸 能产 N i s i n 与 文献 4 1 中乳酸链球菌及其亚种的形态特征和生化 特性 描述 一致 初 步鉴定 该菌 为乳酸链 球菌 亚种 参 考 文 献 1 R E U N AN E N J S A R I S P E J B i o a s s a y f o r n is i n s a u s a g e A s h e l f s t u d y o f n i s i n i n c o o k e d s a u s a g e J Me a t S c i e n c e 2 0 0 4 6 6 4 5 1 5 5 1 8 f 2 D O D D H M H A O Z I m p r o v e d m e d i u m fo r L a c t ic s t