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环境工程微生物学实验指导书环境与市政工程学院环保实验室2007年 7月28日实验一 光学显微镜的操作及测微尺的使用一、实验目的1. 掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养2.观察细菌的形态，并学会测量细菌的大小。二、实验原理1显微镜的结构和各部分的作用显微镜分机械装置和光学系统两部分(图11)。(1)机械部分 镜筒：镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜简有单筒和双筒两种。双筒者可调节两筒之间的距离，以适应不同瞳距者使用。转换器：转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。不同规格的物镜分别安装在各孔上。载物台：载物台是放置标本的平台，中央有一圆孔，使下面的光线可以通过。两旁有弹簧挟用以固定标本或载玻片。有的载物台上装有自动推物器。镜臂：镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式(可改变倾斜度)两种。镜座：镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。调节器：调节器包括大、小螺旋调节器(调焦距)各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。 (2)光学部分目镜：一般使用的显微镜具有23个目镜，其上常刻有“5x”、“l0x”或“15x”等数字及符号，意即使用时可放大5倍、l0倍或15倍。观察微生物时常用放大l0倍或15倍的目镜。物镜：物镜装在转换器上，可分低倍镜、高倍镜和油镜三种，其相应的放大倍数常是10、40、100。物镜的性能由数值孔径(numerical aperture，NA)决定，数值孔径n.sin/2其意为玻片和物镜之间的折射率n乘上光线投射到物镜上的最大夹角的一半的正弦。光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能越大，该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。n是影响数值孔径的因素，显微镜的总放大倍数为物镜放大倍数和目镜放大倍数的乘积。聚光器：聚光器安装在载物台的下面反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度，造成适宜的光锥角度，提高物镜的分辨力。聚光器可上、下调节，以求得最适光度。案光器还附有虹彩光圈，推动把手可随意调整透进光的强弱。合理调节案光器的高度和光圈的大小，可得到适当的光照和清晰的图像。反光镜：反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯光时用凹面镑。它可自由转动方向。反光镜可反射光线到聚光器上。有的显微镑不具反光镜，使用的是电光源。滤光片：可见光由各种颜色的光组成，不同颜色的光线波长不同。如只需某一波长的光线时，就要用滤光片。选用适当的滤光片，可以提高分辨力，增加影像的反差和清晰度。滤光片有紫、青、蓝、绿、黄、橙、红等各种颜色，分别透过不同波长的可见光，可根据标本本身的颜色，在聚光器下加相应的滤光片。 三、实验装置与设备1.实验设备（1）生物显微镜。（2）测微尺四、实验步骤1显微镜使用方法(1)低倍镜的使用法a.置显微镜于固定的桌上。b.旋动转换器，将低倍镜移到镑筒正下方，和镜筒对直。c.转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜仔细观察，使视野亮度均匀。d.将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔正中。e.将粗调节器向下旋转(或载物台向上旋转)，眼睛注视物镜，以防物镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约0.5cm处时停止旋转。f.左眼向目镜里观察，将租调节器向上旋转，如果见到目的物但不十分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。g.如果粗调节器旋转得太快，使超过焦点，必须从第e步重调，不应正视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。h.观察时两眼同时睁开，如用左眼看显微镜，有眼看桌上纸张，便可一面看一面画出所看到的物像。(2)高倍镜的使用法使用高倍镜前，先用低倍镜观察，发现目的物后将它移至视野正处。旋动转换器换高倍镜，如果高倍镜触及载玻片应立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了,换高倍镜时基本可以看到目的物若有点模糊，用细调节器就清晰可见。 (3)油镜的使用方法如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。在载玻片上滴一滴香柏油(或液体石蜡)，将油镜移至正中使油镜镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。用细调节器微微向上调(切记不用粗调节器)即可。用油镜观察完毕，用擦镜纸将镜头上的油擦净、纸蘸少许二甲苯擦试镜头，再用擦镜纸揩干。(4)显微镜的保护法显微镜应放在干燥的地方，使用时需避免强烈的日光照射。物镜和目镜不清洁时，应当用擦镜纸或软绸揩干。用完显微镜后，应当立即放到镜匣中。2目测微尺、物测微尺及其使用方法(1)目测微尺 目测微尺是一圆形玻片，其中央刻有5mm长的、等分为50格(或100格)的标尺，每格的长度随使用目镜和物镜的放大倍数及镜筒长度而定。使用前用物测微尺标定，用时放在目镜内。(2)物测微尺 物测微只是一厚玻片。中央有一圆形盖玻片。中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，每格为10um，用以标定目测微尺在不同放大倍数下每格的实际长度。(3)目测微尺的标定 将目测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；把物测微尺放在载物台上使刻度朝上，用低倍镜找到物测微尺的刻度，移动物测微尺和目测微尺使两者的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。再求出高倍镜下目测微尺每格的长度。(4)菌体大小的测量 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当的物镜测量目的物大小，分别找出菌体的长和宽占目测微尺的格数，再按目测微尺l格的长度算出菌体的长度和宽度。3细菌个体形态的观察 (1)严格按光学显微镜的操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序观察各示范片，并用铅笔分别绘出其形态图。(2)选择一种细菌，量出其尺寸。五、实验结果1结果 分别绘出在显微镜下观察到的细菌形态，及细菌的尺寸。六、实验结果讨论(1)镜检玻片标本时，为什么要先用低倍物镜观察，而不是直接用高倍物镜或油镜观察?(2)用油镜观察时为什么要在载玻片上满加香柏油?(3)为什么目测微尺必须用物测微尺标定?在某一放大倍数下，标定了目测微尺，如果放大倍数改变，它还需重新标定吗?实验二 原生动物及微型后生动物的观察一、实验目的1建立对活性污泥及常见微生物的感性认识，掌握微生物活体观察技术；2掌握根据微生物种类数量判别活性污泥的状况。二、实验原理污水处理厂活性污泥中含有大量的原生动物及微型后生动物，这些原生动物及微型后生动物可作为污泥活性的指示生物。利用生物显微镜对原生动物及微型后生动物进行观察，根据其种类和数量可判定活性污泥的活性。三、实验装置与设备1显微镜。2活性污泥。取自污水处理厂曝气池。3l00mL量简、载玻片、盖玻片、玻璃小吸管、橡皮吸头、镊子。四、实验步骤1肉眼观察取曝气他的混合液置于100ml量筒内，直观活性污泥在量筒中呈现的絮绒体外观及沉降性能(30min沉降后的污泥体积)。2制片取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片中央(如混合液中污泥较少，可待其沉淀后，取沉淀污泥一小滴加到载玻片上；如混合液中污泥较多，则应稀释后进行观察)。加盖玻片时应使其中央已接触到水滴后才放下，否则会在片内形成气泡，影响观察。3镜检在显微镜下低倍或高倍下观察生物相。(1)污泥茵胶团絮绒体 形状、大小、稠密度等。(2)丝状微生物 伸出絮绒体外的多寡。(3)微型动物 微型动物的识别参阅教材。五、实验结果列举镜检的主要生物相，并绘制其生物图。六、实验结果讨论根据实验观察情况，试对污水厂活性污泥质量及运行情况作初步评价。实验三 微生物细胞的计数一、实验目的1掌握血球计数板的原理和使用方法；2能熟练使用血球计数半对微生物细胞悬液进行细胞计数。二、实验原理血球计数板(图3-1)是由一块比普通玻片厚的特制玻片制成的。玻片中央刻有四条槽，中央两条槽之间的平面比其他平面略低，中央有一小槽，槽的两边的平面上备刻有9个大方格，中间的一个大方格为计数室，它的长相宽各为1mm，深度为0.1mm，其体积为0.1mm3。计数室有两种规格：一种是大方格分成16中格，每一中格分成25小格，共400小格；另一种是把一大方格分成25中格，每一中格分成16小格，总共也是400小格。计算方法如下： (1)16x25的计数板计算公式细胞数m1（100小格细胞数/100）x400xl0 xl000x稀释倍数 (2)25x16的计数板计算公式细胞数m1（80小格细胞数/80）x400xl0xl000x稀释倍数三、实验装置与设备显微镜、血球计数板、移液管、酵母菌液。四、实验步骤1稀释样品。为了便于计数，将样品适当稀释，使每格约含5个细胞。2取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取少许充分格匀的待测苗液于盖玻片的边缘，菌液则自行渗入计数室，静置510min即可计数。3将血球计数板置于载物台上，用低倍镜找到小方格网后换高倍镜观察计数。需不断地上、下旋动细调节器，以便看到计数室内不同深度的菌体。现以16x 25规格的计数板为例，数四个角(左上、右上、左下、右下)的四中格(即l00小格)的酵母菌数。如果是25x16规格的计数板，除取四个角上四中格外，还取正中的一个中格(即80小格)，对位于格线上的酵母菌只计格的上方及左方线上的酵母茵，或只计下方及右方线上的酵母菌。每个样品重复计数3次，取平均值，再按公式计算每1m1菌液中所含的酵母菌数。五、实验结果将实验结果计入下表：重复试验4或5个中方格中总菌数稀释倍数菌液浓度（个/ml）123平均六、实验结果讨论根据实验体会，说明用血球计数板进行微生物计数时，其误差来自哪些方面？如何避免?实验四 微生物纯种分离及初步鉴定（综合性实验）一、实验目的该综合性试验包括以下内容：（1）培养基的配制与高压蒸汽灭菌：目的是让学生建立微生物营养的概念，掌握营养琼脂培养基的制备方法和灭菌原理、方法，初步建立微生物试验的“无菌操作观念”。（2）细菌纯种分离、培养和接种技术：目的是让学生掌握从环境中分离微生物纯种，掌握纯种菌种的培养接种技术，）进一步树立无菌观念，学会无菌操作的实验技术。（3）细菌纯种的菌体、菌落形态的观察：目的是让学生建立对细菌菌落的感性认识，掌握对细菌菌落形态的描述方法，并通过菌落特征初步对细菌进行分类。（4）微生物的染色：目的是让学生掌握细菌革兰氏染色的原理及方法，对细菌进行革兰氏染色的阴阳性鉴定。（5）过氧化氢酶的定性测定：通过此实验对纯种分离的细菌进行过氧化氢酶的阴阳性判定，加深对细菌胞外酶催化生物化学反应的感性认识。二、实验装置与设备1培养基的配制与高压蒸汽灭菌：(1)培养皿(直径90mm)、试管、吸管、锥形瓶、烧杯(2)纱布、棉花、报纸、牛皮纸。(3)pH试纸、洗液、10HCl、10NaOH。(4)牛肉膏、蛋白胨、氯化纳、琼脂、蒸馏水。(5)高压蒸汽灭菌器、烘箱、冰箱、电炉等。2.细菌纯种分离、培养、接种技术、菌落观察：(1)无菌培养皿(直径90cm)10套，无菌移液管1ml2支、10m11支。(2)营养琼脂培养基1瓶活性污泥或土壤或湖水菌稀释水90mLl瓶、9mL的5管。(3)接种环、酒精灯、恒温箱。3.革兰氏染色(1)显微镜、香柏油(或液体石蜡)、二甲苯、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯。(2)草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95乙醇、番红染液。三、实验步骤1培养基的配制与高压蒸汽灭菌： a玻璃器皿的洗涤与包装 (1)洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用去污粉或肥皂洗刷，并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干备用。 (2)包装 培养皿由一底一盖组成一套，按实验所需的套数一起用皮纸包装。 吸管应在吸端用铁丝塞入少许棉花，构成l-1.5cm长的棉塞（以防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内)。棉塞要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管中。将塞好棉花的移液管的尖端，放在45cm宽的长纸条的一端,移液管与纸条约成30夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端(图4-1)，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。按实验需要，可单支包装或多支包装，待灭菌。试管和锥形瓶等的管日或瓶口均需用棉塞堵塞。做好的棉塞，四周应紧贴管壁和瓶口，不留缝隙，以防空气中微生物会沿棉塞皱折浸入。棉塞不宜过松或过紧，以手提棉塞，管、瓶不掉下为准。棉塞的23应在管内或瓶口内，上端露出少许，以便拔塞。棉塞的大小及形状应如图42所示。待灭菌的试管和瓶子的口都要用牛皮纸包裹，并用线绳捆扎后存放在铁丝篓内(用纸包裹是为了避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞)，以备灭菌。 b培养基的制备 (1)步骤配制溶液：取一定容量的烧杯盛入定量无菌水，按培养基配方(见附录三)逐一称取各种成分，依次加入水中溶解，难溶的物质，例如蛋白陈、肉膏等可加热促进溶解，待全部溶解后，加水补充加热蒸发的水量。加热对应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。调节PH：用PH试纸测定培养基溶液的pH。按要求以l0Hcl或10NaoH调整至所需的PH。过滤：用纱布、滤纸或棉花过滤均可。如培养基内杂质很少，可省略过滤。分装：按图4-3所示，将培养基分装于试管或锥形瓶中(注意防止培养基沾污管口或瓶口，避免浸湿棉塞引起杂菌污染)，装入试管的培养基量视试管的大小及需要而定，一般制斜面培养基时，每支试管装量为试管高度的1/41/3。斜面培养基的制作：将装有琼脂培养基的已灭菌的试管趁热取出，斜置于木棒(或橡皮管)上，使试管内的培养基斜面长度为试管长度的l/31/2，待培养基凝固后即成斜面(图4-4)。 (2)营养琼脂培养基的制备 培养基配方：牛肉膏0.75g，蛋白陈1.5g，0.75g，琼脂3g，蒸馏水150mL， pH7.6。0.1MPa下灭菌 20min。 操作： 取300ml的烧杯一个，装150m1蒸馏水。 在药物天平上依次称取配方中各成分，放入水中溶解，待琼脂完全融合后停止加热，补足蒸发损失的水量。用10NaOH调整pH至7.6，本实验省略过滤。将培养基分装5支试管中，其余的全部倒入250ml的锥形瓶中，分别塞上棉塞，包扎好待灭菌。 c无菌水的制备 (1)取一个250m1的锥形瓶装90(99)ml蒸馏水，塞棉塞，包扎，待灭菌。 (2)另取5支18mm180mm的试管，分别装9ml蒸馏水，塞棉塞，包扎，待灭菌。 d灭菌 灭菌是用物理、化学因素杀死全部微生物的营养细胞和它们的芽孢或孢子)。消毒和灭菌有些不同，它是用物理、化学因素杀死部分或全部微生物的营养细胞及一部分芽抱。灭菌的操作过程使用前，先在灭菌锅内加入适量的水然后把灭菌的物品放入锅内，盖上锅盖，对称地拧紧螺栓，以防漏气。在灭菌锅底部加热、同时打开排气阀、待自徘气阀冒热气35min后关闭。至压力表所示压力升至所需压力时开始计时。通过调整热源，而维持一定的疙力。达到灭菌时间后，停止加热。待锅内蒸汽全部排完后（压力表示零)，方可打开排气阀，打开锅盖，取出灭菌物。如果压力末达到零就打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。将灭菌后的培养基置于37恒温箱中2物，作无菌培养，若无菌生长，可保存备用。2. 细菌纯种分离、培养、接种技术、菌落观察：(1)平板划线分离法平板的制作：将融化并冷至50的营养琼脂培养基10-15ml倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。划线：以无菌操作，右手持经酒精灯灭菌冷却的接种环挑一环活性污泥(或土壤悬液)。同时左手持培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀起半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线(切勿划破培养基)，划线的方式可取图4-5任何一种；划线完毕盖好皿盖，倒置，于30恒温箱中培养48h后观察结果。(2)接种斜面培养基 接种前将桌面擦净，将所需的物品整齐有序地放在桌上。将试管贴上标签，注明接种日期、接种人、组别、姓名等。点燃酒精灯。先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。在火焰旁，右手持经酒精灯灭菌冷却的接种环(环以上凡是可能进入试管的部分都应灼烧)，同时左手持培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀起半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板单菌落上轻轻挑取少许菌种，将接种环停留在无菌范围内，放下平板，拿起待接种试管，用右手小指、无名指和手掌夹住棉塞将它拔出。试管口在火焰上微烧一周，将管口上可能沾染的少量菌或带菌尘埃烧掉。将挑取菌种的接种环伸入试管底部，在斜面上由底部向上划曲线。抽出接种环，将试管塞上棉塞并插在试管架上，最后再次烧红接种环，则接种完毕，置于30恒温箱中培养24-36h后观察。(3)菌落形态特征的观察 由于微生物个体表面结构、分裂方式、运动能力、生理特性及产生色素的能力等各不相同，个体及它们的群体在固体培养基上生长状况各不一样。按照微生物在固体培养基上形成的菌落特征，可粗略辨别是何种类型的微生物。应注意菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、菌丛高度、颜色、透明度、气味、粘滞性、质地软硬情况、表面光滑与粗糙情况等。通常，细菌菌落多为光滑型，湿润，质地软、表面结构特征很多，具各种颜色。但也有干燥粗糙的，甚至呈霉状但不起绒毛。酵母菌菌落呈圆形，大小接近细菌，表面光滑，质地软，颜色多为白色和红色。放线菌的菌落硬度较大，干燥致密，且与基质结合紧密，不易被针挑取。菌落表面呈粉状或皱折，呈龟裂状，具有各种颜色，且正面和背面颜色不同。霉菌菌落长成绒状或棉状，能扩散生长，疏松，用接种环很易挑取。 对微生物在斜面培养基上生长的特征进