10器官培养.ppt

器官培养主要指植物根 茎 叶 花及小果实的无菌培养 器官培养的特点在于能保持它们所具有的特征性结构 通过器官培养可快速大量地繁殖 目前这一技术已在生产上得到广泛应用 本章将介绍离体根的培养 茎的培养和叶的培养 第七章器官培养 第一节根的培养离体根的培养 由于具有生长迅速 代谢活跃及在已知条件下可根据需要增减培养基中的成分等优点 多用于探索植物根系的生理及其代谢活动 一 培养过程 现以番茄根为例 介绍其培养过程 图6 1 番茄种子经表面消毒 在无菌条件下萌发 待根伸长后 从根尖一端切取10mm长的根尖接种于培养基中 图7 1番茄离体根培养的过程1 种子用70 酒精消毒1分钟 2 用饱和漂白粉液消毒10分钟 3 用无菌水洗三次 4 将6 10粒种子放入培养皿中的湿滤纸上 5 培养皿放入暗中培养直至胚根长至30 40mm 6 切取10mm长的根尖用无菌的接种环接种于培养液中 7 在25 下培养直到长出侧根 暗培养4天后长出侧根 7天后又可切离侧根的根尖作为新的培养材料再进行扩大培养 通过这种由单个直根衍生而来 并经继代培养而保持遗传性一致的根的培养物 可称为离体根的无性系 二 培养基目前培养番茄离体根时 使用改良的怀特培养基 表6 1 培养基中氮源以硝酸盐的效果好 蔗糖是双子叶植物离体根培养最好的碳源 与怀特培养基相比 降低了大量元素的浓度 但甘氨酸和烟酸的用量增加 硫胺素 维生素B6 对离体根培养的作用明显 所用浓度仍为0 1mg L 在这个培养基中增加了碘的成分 因为碘有利于番茄根的生长 浓度为0 38mg L 硼对离体根的生长也具有重要的影响 缺硼会降低根尖细胞的分裂速度 阻碍细胞伸长等 对离体根培养研究得最多的是胡萝卜 用White培养基添加0 01mg L的2 4 D和0 15mg L的KT使胡萝卜肉质根形成愈伤组织 将未分化的愈伤组织球形细胞转入到含低水平生长素的培养基中 细胞先形成根 再产生不定芽 长成小植株 用胡杨的根段进行离体培养 在根段的上面先形成愈伤组织 后再分化产生出小植株 生长调节物质对离体根生长的影响 因植物种或品种的不同而存在差别 如离体根对生长素的反应有三种情况 1 生长素促进根的生长 如玉米 小麦等 2 有些植物离体根的生长要依赖于生长素的作用 如黑麦 小麦的一些变种 3 生长素抑制植物离体根的生长 如樱桃 番茄等 第二节茎的培养根据取材部位茎的培养可分为茎尖培养和茎段培养 关于茎尖培养详见第八章 这里只讨论茎段的培养 一 茎段培养过程茎段培养是指带有腋 侧 芽或叶柄 长数厘米的茎节段进行离体培养 由于嫩茎段 即当年萌发或新抽出的尚未完全木质化的枝条 其细胞的可塑性大 容易离体培养 常作为外植体 一般在无菌条件下 将经过消毒的茎段切成数厘米长带节的节段 接种在固体培养基上 茎段可直接形成不定芽或先诱导形成愈伤组织 再脱分化形成再生苗 把再生苗进行切割 转接到生根培养基上培养 便可得到完整的小植株 现以月季为例说明 一 培养基诱导萌芽培养基MS BA0 5 1 0mg L 增殖培养基MS BA1 0 2 0mg L NAA0 01 0 1mg L或MS BA1 0 2 0mg L IAA0 1 0 3mg L 生根培养基1 2MS NAA0 1 0 2mg L IAA1 0mg L或1 2MS IBA0 75mg L NAA0 2mg L 蔗糖2 二 培养过程 1 取材生长健壮的当年生枝条 取其饱满的未萌芽的作为外植体 一般取中部的侧芽诱导效果最好 2 灭菌 切去叶片及叶柄 切成1 2cm的带节茎段 如果是嫩梢需切去少许芽的顶部 将原来向下的茎端切成斜面 向上的茎端切成平面 这是为了以后接种时方便 也为了避免接种时将上下颠倒 将清理好的材料在自来水下冲洗干净 然后在无菌条件下用70 酒精表面消毒30s 用无菌水洗3 4次 用0 1 的升汞溶液灭菌8 12min 或用2 漂白粉溶液灭菌8 12min 取出后在无菌水中清洗4 5次 用漂白粉溶液灭菌的清洗3 4次 3 接种 生长及分化在无菌条件下操作 将茎段两端用解剖刀切去少许 以除去被杀菌剂伤害的组织 接种在诱导培养基上 7d后芽开始萌发 茎尖展叶生长 20d后长至1 2cm 4 继代培养萌生芽会不断长大 并可从茎段上分化出若干个丛生芽 这时可通过侧芽增殖和丛生芽再生的方式进行继代增殖 切割出丛生芽或将幼芽分切成每段含1 2个节的茎段 转入增殖培养基中 每隔4周继代一次 对于增殖率过高的品种 小苗会变得非常细弱 一般需要转入MS BA0 3MG l NAA0 1mg L 或IBA0 3mg L 的低分裂素培养基中进行壮苗培养 再转入生根培养基中 5 生根培养 将继代增殖的丛生苗切成长度为2 3cm的单株 转入生根培养基中 12d后便可生根 当根长0 5cm 有2 4条白色的根系时即可出瓶移栽 在生根培养基中加入0 3g L活性炭可提高生根质量 茎段 不定芽 再生苗 生根 盆栽 愈伤组织 芽分化 球茎类花卉是一类变态茎 球茎 鳞茎 的植物 其繁殖可用分球或鳞片进行离体培养 达到大量增殖 球茎类通常在地下培育 污染率比较高 对百合的鳞茎消毒时 要把外面几层的鳞片剥去 认真用水清洗后 再将鳞茎底部脏的部分用锋利小刀剥去 在超净工作台上用70 酒精浸半分钟 然后在0 1 升汞溶液中浸泡10 12min 用无菌水冲洗3 4次 用消毒的滤纸吸干表面水分 切取鳞片接种于培养基上 通过芽的诱导 增殖 成球与生根 培养成了完整植株 二 培养基诱导 扩繁和生根培养基大量的用MS培养基 再加入不同浓度的不同种类的生长素和细胞分裂素 这是百合鳞茎诱导的植株 第三节叶的培养很多植物如香叶 天竺葵 秋海棠等的叶片具有很强的再生能力 由于取材方便 数量多且均一性较强 为适宜的外植体 一 培养过程 叶片从枝上摘取后 用水冲洗数小时 通过表面消毒后接种于固体培养基上 叶片在培养基的生长状况大多依赖于叶子离体时的成熟程度 一般说来 幼叶比近成熟的叶生长潜力大 很多植物的叶组织在离体培养条件下先形成愈伤组织 然后通过愈伤组织再分化出胚状体 茎 叶和根 图7 2 图7 2由叶组织培养经愈伤组织及胚状体再生植株 如从香石竹顶芽或腋芽下面取叶片 平放在MS 1mg LBA培养基上 5天后外植体开始膨大 基部略有绿色愈伤组织形成 10天后开始从基部分化出浅绿色小芽点 并逐渐长成小芽丛 经过生根培养后得到完整小植株 离体叶的培养也可以发生不定芽结构 二 培养基离体叶经诱导愈伤组织培养基 生长素与细胞分裂素的比值较大 的培养 形成愈伤组织 愈伤组织转接在分化培养基 生长素与细胞分裂素比值较小 上 分化出不定芽 如 长寿花实生苗叶片 经表面消毒后 切成 5cm 0 5cm的方块 接种于MS 1mg L2 4 D 0 1mg LBA培养基上 经过30天左右的培养 叶片边缘开始出现淡绿色颗粒状突起 继续培养后颗粒突起逐渐扩大 以后形成质地致密的淡绿色愈伤组织块 经继代培养后 获得大量愈伤组织 将愈伤组织切成0 5cm 0 5cm的大小 接种到培养基MS 1mg LBA 0 1mg LNAA上 15天后愈伤组织明显转绿和增大 50天左右开始产生绿色芽点并陆续分化出芽 每块愈伤组织可分化出5 6株无根苗 在1 2MS培养基上 全部长出不定根 杨树 中华猕猴桃等植物常从叶柄或叶脉的切口处形成愈伤组织 用绿巨人幼叶的叶柄 在含5mg LBA的MS培养基中培养 2个月后叶柄处形成致密绿色愈伤组织 每块愈伤组织上可分化8 10个不定芽 当不定芽长至0 5cm时 将不定芽同一部分愈伤组织移入到含2mg LBA和0 2mg LNAA的培养基中 不定芽迅速伸长并长成健壮小苗 大蒜贮藏叶及水仙的鳞片叶直接或经愈伤组织再生出球状体或小鳞而发育成再生植株 叶离体培养可直接形成不定芽结构 用绿巨人幼叶接种到MS培养基中 在0 2 0 5mg LBA和0 7 2mg L2 4 D的诱导下 5周后切口处出现绿色突起 再接种到不定芽诱导和增殖培养基 MS 2 3mg LBA 0 3 0 4mg LNAA 后 3 4周形成不定芽 切割小芽继续培养 每4周可增殖4 6倍 用大豆叶柄基部插入分化培养基 1 2MS 1mg LBAP 上诱导 2周后从叶柄基部长出小芽和丛芽 诱导率达60 70 第四节原球茎培养在兰科植物组培中 常从茎尖 侧芽或种子培养中产生原球茎 前者可看成器官培养 后者可看成胚培养 原球茎可以增殖萌发出小植株 一 以茎尖培养来诱导原球茎 一 取材及灭菌从生长的植株上切取5 15cm的新芽 去掉苞叶 用流水冲洗干净 放入70 酒精中浸泡数秒钟 用无菌水冲洗后 在加有几滴吐温 20的饱和漂白粉上清液中浸10min左右 然后用无菌水冲洗2 3次 置消毒滤纸中吸干水分备用 二 茎生长点的剥取在超净工作台上 将经过灭菌的备接材料置于双筒解剖镜下 用解剖工具将外表的幼叶剥掉 露出带少数叶原基的生长点后 用小刀切取芽 三 原球茎的诱导培养 兰花的茎尖可采用不同的培养基进行培养 如B5 White MS 1 2