基于微量量热法的清开灵注射液质量一致性和稳定性初步研究.doc

基金项目 国家杰出青年科学基金项目 30625042 国家中医药管理局研究专项 06 072P58 国家自然科学基金面上项目 30701109 作者简介 武彦舒 男 1983 年生 陕西榆林人 中药学硕士 主要从事中药质量标准研究及品质评价 TelE mail wys0102 通讯作者 肖小河 Tel 010 66933322 E mail pharmacy302 杜晓曦 E mail duxx 1 基于微量量热法的清开灵注射液质量一致性和稳定性初步研究 武彦舒 1 2 张 倩1 2 金 城1 鄢 丹1 焦 懿3 肖小河1 杜晓曦4 王 建2 1 解放军 302 医院 全军中药研究所 北京 100039 2 成都中医药大学 药学院 成都 611137 3 湖南中医药大学 药学院 长沙 410002 4 国家食品药品监督管理局 药品审评中心 北京 100038 摘要摘要 目的目的 研究清开灵注射液作用于金黄色葡萄球菌的生物热活性指纹图 谱 探索清开灵注射液质量的生物活性评价新方法 方法方法 采用微量量热法 在 合适测试浓度下 分别测定各清开灵注射液样品生物热活性指纹图谱 并进行 定性 定量分析 结果结果 不同厂家及同厂家不同批次清开灵注射液样品的生物热 活性指纹图谱相似度及热动力学参数存在不同程度差异 一个过期样品亦可被 区分 结论结论 该方法简便可靠 可为清开灵注射液的质量控制提供参考 为从活 性角度研究中药注射液的质量一致性和稳定性提供了一种很好的思路 关键词 微量量热法 清开灵注射液 金黄色葡萄球菌 生物热活性指纹图谱 一致性 稳定性 Investigation of consistency and stability of Qingkailing Injection based on by microcalorimetry WU Yan shu1 2 ZHANG Qian1 2 JIN Cheng1 YAN Dan1 JIAO Yi3 XIAO Xiao he1 DU Xiao xi4 WANG Jian2 1 PLA Institute of Chinese Materia Medica 302 Hospital of PLA Beijing 100039 China 2 Pharmacy College Chengdu University of TCM Chengdu 610075 China 3 Pharmacy College Hunan University of TCM Changsha 410002 China 4 Centre for Drug Evaluation SFDA Beijing 100038 China Abstract Objective To investigate the bioactivity finger print of Qingkailing Injection on staphylococcus aureus and to search new method for evaluating 2 bioactivity of Qingkailing Injection Methods The bioactivity finger prints of different Qingkailing Injection on staphylococcus aureus were determined by microcalorimetry analyzed qualitatively and quantitively An expired sample was also distinguished Results The similarity and thermomechanical parameters were something deffrence of Qingkailing Injection from different factories and different batches Conclusion The result showed that this method is single practicable and reliable as a reference method for the quality control of Qingkailing Injection A new direction was provided for investigating consistency and stability of traditional Chinese medicine injection Key words Microcalorimetry Qingkailing Injection staphylococcus aureus bioactivity finger print consistency stability 清开灵注射液组方源于中医治疗急性热病传统处方 温病三宝 中的安宫 牛黄丸 由胆酸 猪去氧胆酸 水牛角 粉 黄芩苷 珍珠母 粉 栀子 板蓝根 金银花等组成 1992 年始清开灵注射液被政府医药管理部门指定为全 国中医医院急诊 科 室必备的中成药 具有清热解毒 化痰通络 醒神开窍 的作用 用于热病神昏 中风偏瘫 神志不清等症 清开灵注射液生产厂家众多 水平参差不齐 质量高低不一 加之其组方 生产工艺复杂 使得目前的质控方法都难以有效保证清开灵注射液的质量 2006 年 SFDA 已针对中药注射液的活性评价做了相关规定 1 中药质量生物 控制已成为中药质量控制研究发展的趋势 2 但是目前这方面的研究相对薄弱 有关方面的报道更是少之又少 结合前期研究 3 4 我们提出从质量一致性 稳定性出发 以清开灵注射液 的抑菌活性为着眼点 采用微量量热法 以生物热活性指纹图谱及热动力学参 数定性定量的表征清开灵注射液的质量 为从活性角度评价清开灵注射液进行 了有益尝试 亦为保障清开灵注射液的安全使用提供参考 1 实验仪器及材料实验仪器及材料 1 1 实验仪器实验仪器 实验仪器采用瑞典 Thermometric 公司产的 LKB 2277 生物热活性检测系统 LKB 2132 蠕动泵 实验时系统控温 37 有关仪器的结构原理见文献 5 6 7 3 1 2 实验材料实验材料 金黄色葡萄球菌 CCTCC AB910393 由武汉大学中国典型培养物保藏中心 提供 培养基为 LB 培养基 取蛋白胨 10 g 酵母粉 5 g 氯化钠 5 g 溶于 1000 mL 蒸馏水中 pH 7 2 分装后于 121 高压蒸气灭菌 20 min 置 4 冰箱中备 用 清开灵注射液样品系 A B 两个大厂家提供 其中 A 厂家样品选择了保质 期内各时间段的样品及一个过期样品 具体见表 1 表 1 清开灵注射液样品一览表 厂 家编 号样品批次生产日期有效期 至 备 注 A5 52010 5 4保质期内 AS2712604A2007 8 312009 8 30保质期内 AS3710510A2007 2 102009 2 9保质期内 AS4612407A2006 10 192008 10 18保质期内 AS5611307A2006 6 22008 6 1即将过期 AS6510605A2005 2 252007 2 24已过期 BS77009302007 9 302010 8 A 保质期内 BS80711202007 11 202010 10 E 保质期内 BS90712192007 12 192010 11 D 保质期内 BS100801042008 1 42010 12 D 保质期内 2 方法与结果方法与结果 2 1 实验方法实验方法 采用停流法检测 测定前分别用适量 0 1 mol L NaOH 0 1 mol L HCl 75 乙 醇溶液和无菌水清洗管道和流通池 待仪器得到稳定的基线后 用蠕动泵以 50 mL h 的流速 将菌液和清开灵注射液混合液泵入微量热计中 当样品充满流通 池后停泵 启动采集卡开始采集数据 跟踪记录流通池内细菌生长的产热曲线 P t 曲线 当采集的数据重新回到基线后 实验结束 8 根据实验要求 将一定量的清开灵注射液加入到接种了金黄色葡萄球菌的 培养液中 使菌含量为 2 106 cells mL 用振荡器混匀 以备进样 整个过程为 无菌操作 2 2 结果与讨论结果与讨论 4 2 2 1 金黄色葡萄球菌的生长热功率输出曲线金黄色葡萄球菌的生长热功率输出曲线 图 1 金葡菌完整代谢曲线 图 1 是 37 下 停流法测定的金黄色葡萄球菌完整代谢曲线 曲线 A P t 曲线 是所测定的细菌生长曲线 可以分成四个阶段 停 滞期 指数生长期 稳定期和 衰亡期 分别对应于细菌对培养基中不同 营养成分的利用情况及不同的代谢过程 采用指数生长模型对金黄色葡萄球菌的生长曲线进行线性拟合 9 ln Pt P0 kt 则得到曲线 B lnP t 曲线 显示了金黄色葡萄球菌热功率输出随时间的 变化特征 图中直线 c 即为指数生长期生长速率常数 K 的直线 2 2 2 清开灵注射液清开灵注射液 量量 效效 关系考察关系考察 图 2 金葡菌浓度梯度图 5 用 S8 样品分别考察了 0 200 L 的 8 个浓度梯度的抑菌活性 线性关系良 好 当剂量到 200 L 时 金葡菌生长曲线已严重变形 不再适用于指数生长模 型 见图 2 曲线 a 由图谱及参数分析 发现在一定范围内 0 150 L 随清开灵注射液剂量 增加 金黄色葡萄球菌生长曲线整体呈 下降 后延 趋势 细菌指数生长期 速率常数 K 最大热功率 P1 第一指数生长期发热量 Q1 稳定期最大热功率 P2 均相应减小 第一指数生长期达峰时间 T1 稳定期达峰时间 T2 稳定期发 热量 Q2 总发热量 Qt 均相应增大 且均与剂量成较好的线性关系 r 分别为 0 994 0 989 0 983 0 991 0 985 0 989 0 998 0 997 2 2 3 不同清开灵注射液样品生物热活性指纹图谱初步分析不同清开灵注射液样品生物热活性指纹图谱初步分析 2 2 3 1 相似度分析 在以上系列浓度中 选择和空白相比参数变化较大 但图谱不发生明显变 形的浓度 50 L 测定了清开灵注射液不同样品作用于金黄色葡萄球菌的生 长曲线 采用向量余角法对不同样品生物热活性指纹图谱进行相似度分析 确 认了 3 个共有峰 a b c 结果见表 2 图 3 表 2 不同清开灵注射液生物热活性指纹图谱相似度分析 编 号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10 相似度 S0 9060 8810 8770 8620 8600 8680 9880 9870 9880 989 图 3 清开灵注射液相似度分析 a 指数生长期 c 稳定期 b 未知 6 2 2 3 2 生物热动力学参数分析 提取清开灵注射液各样品生物热动力学参数 具体参数见表 3 表 3 清开灵注射液生物热活性指纹图谱生物热动力学参数 S n 5 X 样样 品品P1 wQ1 mJK min 1P2 wQ2 mJQt mJ S121 009 0 64164 606 0 9280 02598 0 0002027 982 0 552362 930 8 708427 536 7 283 S220 484 0 25860 779 0 5710 02606 0 0001926 984 0 905337 856 5 922398 635 8 463 S319 552 0 40265 444 0 7020 02266 0 0001424 904 0 387346 469 7 925411 913 5 834 S421 949 0 47165 818 1 0220 02603 0 0003830 921 0 500365 276 9 108431 094 11 074 S521 796 0 38669 249 0 5270 02264 0 0003131 523 1 002379 912 7 005449 161 8 713 S620 761 0 81066 396 1 3240 01901 0 0003428 334 0 725370 504 8 557436 900 7 253 S719 949 0 19959 456 0 8000 02333 0 0004327 135 0 417313 425 5 859372 881 7 902 S822 403 0 50565 932 0 9910 02451 0 0003226 437 0 770293 776 3 900359 708 6 738 S919 633 0 62358 169 1 7250 02309 0 0004027 862 0 696315 895 6 853374 064 7 409 S1018 844 0 27759 409 1 3090 02265 0 0003126 023 0 804303 371 8 412362 780 7 595 P1 为指数生长期最大热功率 P2 为稳定期最大热功率 K 为指数生长期生长速率常数 Q1 为指数生长 期发热量 Q2 为稳定期发热量 Qt 为总发热量 综合分析 虽然清开灵注射液剂量与参数 T1 P1 Q1 K T2 P2 Q2 Qt 均有较好的线性关系 但指数生长期生长 速率常数 K 和总发热量 Qt 更能表征药物作用于细菌随时间生长变化特征和总 体特征 故选 K Qt 作为基本评价参数 以样品编号为因素变量 热动力学参数 K Qt 为因变量 进行单因素方差 分析 ANOVA 组间有显著性差异 P 0 05 提示清开灵注射液各样品间有 一定的差异 见表 4 表 4 单因素方差分析 ANOVA Sum of SquaresdfMean SquareFSig KBetween Groups 1369 015104 071 000 Within Groups 00640 000 Total 14249 QtBetween Groups50016 53295557 39288 169 000 Within Groups2521 2504063 031 Total52537 78349 2 2 3 3 综合聚类分析 以生物热活性指纹图谱相似度 S 参数 K Qt 进行多指标聚类分析 见图 4 7 图 4 不同清开灵注射液样品聚类分析 所有样品首先被区分为两大类 其中 S7 S9 S8 S10 被聚为一类 为 B 厂家 样品 S1 S4 S5 S2 S3 S6 被聚为一类 为 A 厂家样品 均与实际相符 样品 S6 为过期样品 可与同厂家其他样品区分 验证了方法的可靠性 样品 S5 临近保 质期 其生物热活性指纹图谱较保质期内其他样品有一定的差异 说明 A 厂家 清开灵注射液临近保质期时 抑菌作用已发生一定的变化 提示质量发生了改 变 2 2 4 讨论讨论 2 2 4 1 微量量热法是基于生化反应中普遍存在的热交换而建立的 能实时 在 线 动态 量化地反应微生物生长代谢过程中的动态整体信息 可提供具有较 强专属性特征的二维信息 其热谱曲线本身即可作为 指纹图 直接全面的反映 微生物生长代谢过程中热量变化的整体特征 从而有效的弥补了常规方法信息 单一的不足 10 2 2 4 2 本研究在样品选择时考虑了不同厂家 不同批次 保质期内不同阶段及 过期样品 具有较强的代表性 可表征清开灵注射液质量一致性 稳定性 2 2 5 3 本研究应用向量余角法计算生物热活性指纹图谱的相似度 在原有的参 数定量分析基础上做到了既定性又定量 完善了生物热动力学谱图分析 为生 物热动力学图谱及参数的科学分析提供参考 2 2 4 4 相同条件下 不同厂家清开灵注射液样品的生物热活性指纹图谱存在较 大差异 在一定程度上反映了清开灵注射液质量的差异性 样品 S5 临近保质期 其抑菌生物热活性指纹图谱已发生一定的变化 提示质量发生了改变 笔者将 结合其他方法从物质层面进行深入研究 8 2 2