百日咳菌苗原液制造及检定要求111333.docx

百日咳菌苗原液制造及检定要求本品系用百日咳第相菌种经培育后取菌体制成悬液，加适当杀菌剂，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释制成，每ml含菌45亿90亿。用于制备百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂。1菌种1.1制造百日咳菌苗之菌种、检定用的相诊断血清、百日咳分型血清及百日咳参考菌苗，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。1.2菌种检定1.2.1培养特性于包-姜（Bordet-Gengou）氏或其他适宜的培养基上培育，各菌株应具有典型的形态及生化特性。1.2.2血清学特性将3537培育4048小时的菌苔，混悬于生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水内，使每ml含菌20亿个，与相血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半。同时与单价分型血清做定量凝集反应，其型别应与该菌种标定型别相同。1.2.3皮肤坏死试验用健康家兔或豚鼠至少2只，用培育4048小时的菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，然后稀释为几个不同浓度的菌液，分别用每一稀释度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮内0.1ml，经72小时观察反应。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4亿个菌以下的菌液部位出现出血性坏死者为阳性反应，判为合格。1.2.4毒力试验用体重1618g之小白鼠至少3组，每组至少10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培育4048小时，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释的菌液0.05ml观察14天，记录小白鼠生死情况，按ReedMuench法计算LD50，LD50菌数不超过1.2亿判为合格。1.2.5免疫力试验1.2.5.1方法按附录2百日咳菌苗原液免疫力试验方法进行。1.2.5.2判定试验菌液每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。若试验菌液的效价低于此要求时，可复试，其结果的几何平均值（如用概率分析法时，应用加权几何平均值）4.0IU，仍判为合格。1.3菌种保存1.3.1菌种应用冻干法保存。1.3.2冻干菌种应保存在28。冻干后抽样按1.2项进行检查，合格的菌种可使用2年，以后每年检查1次，如仍合格可继续使用1年。2.制造2.1制造百日咳菌苗原液至少应选用2个菌株，制成的菌苗应含1、2、3型因子。2.2制造百日咳菌苗原液用活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基。如用液体培养基，不得含有已知引起人体毒性或变态反应的成分。2.3原液制造2.3.1菌种冻干菌种启开后接种于改良包-姜氏或活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基上。于3537培育不超过72小时，以后各代不超过48小时，传代菌种保存不得超过14天，冻干菌种启开后用于生产时不应超过10代。2.3.2培育可用固体法或液体法培育。培育时间不得超过48小时，经检查为纯菌后，用适当方法收集菌体，混悬于pH值为7.07.4的磷酸盐缓冲生理盐水中。2.3.3杀菌原液可用不超过0.1%（ml/ml）甲醛溶液杀菌，放3723天。亦可用其他适宜的杀菌剂和杀菌方法杀菌。2.3.4纯菌试验原液应逐瓶（罐）抽样接种普通琼脂斜面及普通血液琼脂斜面（或活性炭半综合培养基）各1管，放3537培育2天，然后放24261天。有杂菌生长者应废弃。2.3.5原液合并固体法工艺生产经纯菌试验合格的原液应进行合并。不同菌株不同日期制造2的原液应分别合并。合并后，可加适量防腐剂，并保存于28。2.4原液检定2.4.1浓度测定每瓶原液应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。稀释菌苗时即按此浓度计算。2.4.2镜检每瓶原液取样稀释至成品浓度，涂片染色镜检，应为革兰氏阴性球杆菌。至少观察10个视野，应无杂菌。2.4.3凝集反应每瓶原液按1.2.2项与相血清做定量凝集试验，其凝集效价应达血清原效价之半，如仅达到或低于血清原效价1/4时，应作免疫力试验，合格后方可使用；同时应用单价分型血清做定性凝集试验，其所含型别应与制造原液的菌种型别相同。2.4.4无菌试验每瓶原液除按生物制品无菌试验规程进行无菌试验外，并做特异无菌试验。如特异无菌试验有百日咳菌生长，可复试一次，若仍有百日咳菌生长，原液应判为不合格。2.4.5毒性试验2.4.5.1方法按附录3百日咳菌苗原液毒性试验方法进行。2.4.5.2判定试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前总体重，第7天小白鼠增加的体重不少于对照组增加体重的60%，并不得有死亡，该批原液毒性试验判为合格。试验