薄层色谱基础知识.doc

薄层色谱基础知识（来自/News_View.asp?NewsID=731）第一篇 基础部分第一章 绪论 薄层色谱是色谱分析技术中的一项重要分支。由于这一方法具有简单、迅速、灵敏高度、分离效能好等优点，因此已广泛一应用于化学分析的多种领域。目前在食品卫生化学分析中，也多采用薄层色谱技术，特别是对食品中的微量有机毒物的分离和分析，更显出薄层色谱的优越性，故已成为食品卫生化学分析中的一项重要技术。第一节 色谱分析的发展 色谱分析是分离混合物组分的一种方法。这种方法是借助于混合物中的组分，在互不相容的两组间进行吸附或分配，以达到分离的目的。本世纪初，植物学家茨维特（Tsw-ett）用菊根粉柱及石油醚分离植物叶子提取物，结果在菊根粉柱上形成了几种植物色素的色谱带，从而分离出植物叶子中的各种色素。这种分离分析的方法，被称为色谱分析法，茨维特因此而被认为是色谱分析的奠基人。但这一方法在较长的时期内并没有被人们所重视。直至1931年以后，人们在应用色谱分析方法分离类胡萝卜素等工作中，提出了色谱分析的原理及其实用价值的报告，于是才逐步完善了这一技术方法，促进了色谱分析的发展。 茨维特所建立的色谱分析方法，被称为液一固吸附色谱法。这种方法是将溶解了的待分离组分的溶液，通过固体吸附剂柱，进行分离。1941年马丁（Wartin）等人，用含有水份的惰性支持剂（如含水硅胶）代替液一固吸附色谱中的固体吸附剂，将样品溶于不溶于水的有机溶剂中，并使通过装有含水的惰性支持剂柱，由于被分离的各组分在有机溶剂及水之间的溶解度不同，从而在两相间进行分配分离，这就诞生了液一液分配色谱。此后，康斯登（Consden）用滤纸代替含水硅胶作隋性支持剂，称之为纸色谱。马丁等进一步将色谱分离系统中的流动相由液体改为气体，并在涂有硅铜油液体的硅藻土支持剂上成功地分离了脂肪酸，创建了一种新型的色谱分析方法。由于这一方法具有分离效能高、速度快等优点，因而得到了迅速的发展，成为目前色谱分析中的一项重要的技术气相色谱法。五十年代中期，斯塔尔（Stahl）发展了一种新型的色谱分析技术薄层色谱法。这一方法将在第三节讨论。由于色谱分析中所用静相物质的不同，于是产生了另外两种色谱分析方法：（1）离子交换色谱。这种方法是以离子交换树脂为色谱分析中的静相，利用交换树脂中的极性化学键，使被分离物质在两相之间形成可逆的反应。（2）凝胶透过色谱。这种方法是用分子筛为静相，用以分离分子大小不同的化合物。第二节 色谱分析分类色谱分析不断发展，出现了多种类型的色谱技术方法，而任何一种色谱分析，被分离的组分都是在两相间进行分离。其中一相是一种含有很大表面积的静止的物质，称为“静相”；而另外一相是通过或者沿着静相的表面流动的物质，称为“动相”。静相可以是固体，也可以是液体（这种液体是附着在惰性支持剂上）；动相可以是液体，也可以是气体。根据每一相的两种可能在色谱分离中所处的状态，可将色谱法分为四种基本类型，即气固色谱、气液色谱、液固色谱、液液色谱，如图11所示。但这一分类方法无法表示色谱分离的性质，图11色谱法分类图动 相气体液体静相固体气固色谱吸附柱色谱薄层色谱液 体气液色谱分配柱色谱薄层色谱纸色谱因而有人提出按色谱分离过程的物理和化学性质分类的方法： （一）吸附色谱：静相为固体吸附剂，包括气固吸附色谱及液固吸附色谱。利用固体吸附剂对混合物中各组分在吸附性能的不同，达到分离的目的。（二）分配色谱：静相为附着在担体上的液体，包括气液分配色谱及液液分配色谱。利用混合物中各组分在两相中的溶解度不同而有着不同的分配系数，从而进行分离。（三）离子交换色谱：静相为离子交换树脂。利用交换树脂中的极性化学键，使被分离的物质在两相间形成可逆的反应，达到分离混合物的目的。（四）凝胶过滤色谱：静相为分子筛。利用混合物中各组分的分子大小的差异，使通过分子筛静相，进行分离。除以上的两种理论的分类方法外，考虑到某些特殊情况，还可以根据色谱操作的技术方法来分类。图12即为这种分类的表示方法。色谱法液相色谱 气相色谱 纸色谱 薄层色谱 柱色谱 气液色谱 气固色谱 液固色谱 液液色谱 离子交换色谱 凝胶过滤色谱图12色谱分析分类法第三节 薄层色谱简述早在1938年依斯迈洛夫（Izmailov）等人在试图将柱色谱的管柱内径缩小到1毫米，从而建立一种“微柱色谱”的工作失败以后，考虑到一种开放式的微柱色谱法。这种方法是在涂有氧化铝薄层的玻璃板上分离药用植物提取液内的生物碱。当时仅用几滴样品溶液，因此称之为“点滴色谱”。继后，人们用这一方法成功地进行了萜、烯等植物挥发油的分离，这一方法才有所发展，被称为“带色谱法”或“板色谱法”。五十年代初，克尔希内（Kirehner）发展了依斯迈洛夫的方法，7但目前广泛使用遥薄层色谱技术，应归功于斯塔尔的工作。他在研究植物细胞组成的过程中，探索了高灵敏度的微量分离方法，详细地研究了以往的微量色谱技术，并将依斯迈洛夫提出的色谱方法中的仪器、吸附剂以及操作条件等标准化，使这一方法进一步发展成为一种新的色谱分析技术。斯塔尔称这种方法为“薄层色谱法”（简称TLC）。薄层色谱实际上是柱色谱的一种改良，薄层板可以认为是一个开放的色谱柱。但就技术操作来看，又很类似纸色谱。其操作方法概述如下：先制备薄层板，即在大小适当的玻璃板上，均匀涂上吸附剂，厚度在一毫米以内，然后在距底边1。5厘米处点上样品溶液，形成一个小点，称为“原点”。再将薄层板置于盛有动相溶剂的玻缸内（此溶剂称为“展开溶剂”，玻缸称为“展开槽”）。当溶剂沿薄层扩散到距原点以上一定距离时（一般1012厘米），取出薄层板，记录展开溶剂扩展前沿距原点的距离A。然后用喷洒显色试剂或紫外光线照射的方法使被分离的化合物显色，此过程称为“显谱”。观察并记录所显斑点的中心距原点的距离。斑点在薄层板上的位置通常用比移值（Rf）表示。Rf值为斑点中心距原点的距离与溶剂展开前沿距原点距离的比值：斑点中心至原点的距离Rf 溶剂前沿至原点的距离Rf值是与物质在两相中分配系数相关的数值，因此，在特定条件下为一常数。不同的物质由于在特定色谱条件下的两相间分配系数的差异，而有着不同的Rf值，这样就达到薄层色谱分离的目的。根据薄层色谱所使用的静相物质的性质，可将薄层色谱分为以下几类：（1）吸附薄层色谱（2）分配薄层色谱（3）离子交换薄层色谱（4）凝胶过滤薄层色谱目前由于薄层色谱不断地发展，这一微量分离技术已显示出比纸色谱法更具有应用价值。其特点如下：（1）混合物展开分离迅速。一般展开一次约在1560分钟，而纸色谱多在几小时至十几小时，因此薄层色谱法更适于快速鉴定。（2）分离效能比纸色谱好。由于展开距离比较短，因此斑点比较致密。（3）样品溶液需要量少。一般为1微升至几十微升。（4）操作简便。不需要特殊昂贵而又复杂的仪器，便于普及。（5）灵敏度高。与纸色谱比较，其灵敏度约高10100倍。（6）受温度变化影响不大。因展开时间较短，不象纸色谱难于控制温度。（7）可以使用强腐蚀性的显色剂。因静相物质多为隋性无机化合物，所以可以使用浓硫酸、浓硝酸、氢氧化钠等强腐蚀性显色试剂。这是纸色谱法所不及的。（8）薄层色谱的分离容量较纸色谱为大，因此用作微量物质分离的制备色谱，较纸色谱为好。（9）可以作为一种纯化手段，与气相色谱、红外分光光度等方法联用。薄层色谱虽然有以上优点，并在色谱分析领域内构成了独特的一个分支。但事物总是一分为二的，薄层色谱也有不足之处。首先，限于操作条件，标准化不易严格控制，因此薄层色谱中Rf值重现性不够理想；其次由于薄层板的脆弱性，色谱不易保存；其三挥发性物质及高分子量化合物的应用上还存在着一定的问题等。因此，必须全面、正确地估价这一技术方法。表11是各种色谱分析技术在各方面的比较，供参考。表11 各类色谱分析技术的比较方 法分离时间分离效能含量测定分 离 情 况挥发性物质非挥发性物质高分子物质纸色谱薄层色谱气相色谱液固柱色谱凝胶过滤色谱离子交换色谱毛细管电泳电泳长短短短中短短长中中特高高中高高中差差很好好好好很好差无用无用可用可用无用可用可用无用可用可用无用可用可用可用可用可用差差无用差可用无用可用可用第二章 原 理薄层色谱是柱色谱的改良，即开放式的柱色薄，而同时又类似纸色谱的操作技术。因此色谱法的一般原理对于薄层色谱也是适用的。在色谱分析中，主要是动相溶剂带动混合物组分流经静相（即色谱柱、薄层板、滤纸等）的过程。根据静相的性质，使被分离的组分基于以下的一种或几种因素，在动相与静相间进行分配，从而达到分离的目的。（1）在静相的表面或内部所持有的液体中进行溶解分配。（2）在静相的表面或孔隙中进行吸附分配。（3）与静相的离子组分形成极性键。在讨论以上现象的基本原理时，首先介绍以下两个名词：分配系数：分配系数为色谱系统中两相内所含被分离物质的浓度比。Kd= （1）式中：Kd：分配系数CS：静相中所含被分离物质的浓度CM：动相中所含被分离物质的浓度分配系数是一个常数，设若被分离的溶质在两相间的分配吸附等温线是一个直线，则分配系数与溶质的总浓度无关，这种情况多为低浓度。 由式样（1）可知，若浓度有较大的分配系数，则溶质与静相有较强的亲和力。在色谱系统中就将保留相当长的时间，也就是说溶液质的移动速度非常缓慢。相反，若溶液质的分配系数小，则溶液质对动相有较强的亲和力，在色谱系统中就将保留较短的时间，也就是说溶液质的移动速度非常迅速。保留因素：物质的色谱分离过程，可以用“保留因素”R值来描述。R值是溶质在色谱系统中的移动速度与一个典型地标准物质（通常是动相溶剂）的移动速度的比值。这一标准物质不被静相所吸附，或者是不溶解在静相中（Kd=0）。R= （2） 式中：TM：溶质留在动相中的时间TS：溶质留在静相中的时间由式（2）可知R值是在01之间的分数，当溶质在静相中保留的时间很短时，则TS值很小，可以忽略，而R值接近于1，溶质很快随动相移动至色谱系统的末端。若溶质在静相中保留的时间过长，则TS值很大，与TS值比较，TM值非常小可以忽略（即等于零）R值将接近于零。溶质将保留在原点不动。一般R值适用于按时间分离的柱色谱。而对于按距离移动分离的薄层色谱及纸色谱，普遍采用比移值Rf来表示溶质的色谱分离过程。此值与R值相似。Rf （3）式中：Rf：比移值a：溶质的移动距离A：动相的移动距离根据色谱中静相对于被分离物质的作用原理，可将薄层色谱分为四种类型，其原理分别为：（一）分配薄层色谱：即被分离的物质在动相溶剂与静相中所含有的液体之间进行分配分离。其原理与纸色谱相同，根据被分离混合物中溶质间的分配系数的不同，进而达到分离的目的。分配系数小的溶质，在动相溶解得多，随动相移动的距离就大；分配系数大的溶质，移动的距离就小，因此使不同的化合物得以分离。化合物的分配系数与Rf值间有以下关系式： Rf （4） 式中： Rf：比移值 AM：动相横截面积 As：静相横截面积 Kd：分配系数式（4）可用下式表示之： Kd （5）在温度一定的条件下，AM/As为一常数。将式（5）两端取对数，则得：logKd=log （6）设 RM=log 则式（6）可改写为 logKd=log +RM由式（7）可以看出化合物的Rf值与分配系数K之间的关系。亦即是被分离化合物的Rf值与该化合物在两项间的分配系数有关。（二）吸附薄层色谱：在薄层色谱中，吸附作用也是一种主要的形式。在用动相溶剂展开时，不同的化合物在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、解吸、再吸附、再解吸的现象。假定分离的全过程被分离的物质的吸附分配系数Kd是一个常数，即吸附等温线为一直线。而且在一固定的色谱系统中，吸附剂的量WA（以克表示）及动相溶剂的量VM（以毫升表示）的比值是一个常数，则被分离物质的Rf值与该物质的吸附分配系数有以下关系式：Rf= （8）另一方面，分配系数Kd与吸附剂、流动相及被分离化合物的性质之间，具有以下的关系式：IogKd=IogVa+ （S0e0Ai） （9）式中：Va：吸附剂的表面体积，以毫升/克表示之，对于一个煅烧过的吸附剂则 Va=（3。5108厘米）表面积厘米2/克 Va=（3。5108厘米）表面积厘米2/克0。01h h代表吸附剂中水份含量的百分比：吸附剂的吸附活动S0：被分离化合物被标准活度（=1。00）的吸附剂从溶剂中吸附的吸附能Ai：被分离化合物的分子面积效应e0：动相溶剂的淋洗强度将式（8）移项则得： （10）式（10）两端取对数则得Iog（ （11）将式（9）代入式（11）则：Iog（ （S0e0Ai） =Iog （S0e0Ai） （12）由式（12）可以看出Rf值与等式右端的所有参数有关，即被分离物质的薄层色谱性质与吸附剂、展开溶剂及被分离化合物的性质等有密切关系。（三）离子交换薄层色谱：离子交换是指在固体颗粒和液体溶剂界面上发生的离子互相交换。离子交换薄层色谱的原理也是基于离子交换的基本原理，应用在薄层色谱操作技术上。在离子交换树脂为静相的薄层板上，点上适量的被分离物质，当用展开溶剂展开时，就发生一系列的洗脱交换和吸留交换现象，随各种离子选择效应的不同，将混合物按一定次序进行分离。在薄层色谱中常用的为离子交换纤维素。（四）凝胶过滤薄层色谱：凝胶过滤色谱（又称凝胶渗透色谱）是利用分子筛为静相物质，结合薄层色谱的操作技术，进行分离分析混合物各组分的一种方法。凝胶是一种多孔性的物质，在色谱分离过程中，大小不同的被子分离的分子，在不同的程度上渗透入凝胶内网络组织的孔隙内。这种渗透是可逆的，进入孔隙的小分子又可以用淋洗溶剂冲洗出来；不能进入孔隙内的较大的分子，则在凝胶颗粒之间的空间内，很快地被动相溶剂淋洗出来。进入孔隙的小分子被动相溶剂淋洗出来的速度以先大后小的次序而分离。如图21所示。总的说来，凝胶色谱是基于凝胶颗粒内孔隙的大小以及被分离化合物分子的大小而分离的。第三章 静相物质与动相溶剂第一节 静相物质薄层色谱中的静相物质主要是一些吸附剂、担体、离子交换树脂、分子筛等，这些物质对薄层色谱分离效果起着重要作用。一般柱色谱常用的静相物质，多数可在薄层色谱中应用，不同的是薄层色谱所用的静相物质的颗粒较柱色谱为细。克尔希内用淀粉为粘合剂系统地研究了一些无机吸附剂，发现以硅胶和氧化铝制成的薄层板分离效果最好，至今仍是薄层色谱中应用最广泛的吸附剂。随着薄层色谱的不断展，近年来还出现了不少应用广泛的有机静相物质，如聚酰胺、纤维素、离子交换纤维素以及凝胶过滤色谱用的多聚葡萄糖凝胶等。以下就常用的静相物质作一简略介绍：911（一）无机静相物质：（1）硅胶：硅胶是由硅胶酸脱水而成，硅胶是薄层色谱中应用最多的一种吸附剂。硅胶结构具有多孔性，孔隙多在20150埃之间。孔隙大小和表面面积大小对吸附性能有很大的影响。经实验证明，用于薄层色谱有硅胶，其粒度以200250目，孔隙在80150埃为适宜。粒度太粗，分离效果不佳；过细，展开速度较慢。硅胶又有很强烈的吸湿性，在相对湿度为4575%时，能吸取720%的水份，这一性质往往使已活化的硅胶吸水，减低其活度。硅胶颗粒表面有大量的OH基，带有一定的酸性（pH45），故适于酸性或中性物质的分离。相对来说，硅胶更适于分离疏水性物质，而分离亲水性物质的效果较差。硅胶对对玻璃有亲和性，容易附着在玻璃上，也是其优点之一。目前，国内外已有适用于薄层色谱的商品硅胶供应。因此实验室自制硅胶吸附剂已无必要。常见的商品硅胶有以下几种规格：1）不加粘合剂的硅胶：即适用于薄层色谱的纯硅胶粉。商品称硅胶H或硅胶N。2）加粘全剂的硅胶：加有15%石膏的硅粉胶，商品称为硅胶G。加有15%淀粉的硅胶，商品称硅胶S。3）含荧光指示剂的硅胶：这类硅胶粉含有无机荧光性物质，如硫化镉等，在短波紫外线照射下，产生绿色荧光，商品称为硅胶GF254、硅胶Guv254或硅胶HF254。4）高纯薄层硅胶：商品称硅胶GHR及硅胶HFHR。（2）氧化铝：氧化铝为应用范围仅次于硅胶的一种薄层吸附剂，吸附力很强。吸附率与氧化铝的结构有关，一般比表面积以100200米2/克为佳。氧化铝的重活化温度在200左右，温度过高会减少它的比表面积，而氧化铝的比表面积低于6米2/克就不能用为吸附剂，故氧化铝不能加热到500以上，商品氧化铝多为碱性（约pH9），但也有中性（约pH7）、酸性（约pH4）氧化铝。氧化铝薄层板主要用来分离碱性和中性的弱极性化合物。在充分减活化的情况下，也可以分离强亲水性的化合物，如醣类、氨基酸等。商品薄层用氧化铝也常加入粘合剂石膏，这样可使氧化铝的碱性减弱，甚至达到中性，因此在需用碱性薄层板时，应加以注意。常用的氧化铝有：1）不加粘合剂的氧化铝：即适用于薄层色谱的纯氧化铝粉，商品称氧化铝H，或氧化铝N。2）加粘合剂的氧化铝：加有石膏的氧化铝商品称为氧化铝G。3）含有荧光指示剂的氧化铝：商品称氧化铝GF254，氧化铝HF254亦有称氧化铝Guv254。（3）硅藻土：硅藻土为粗二氧化硅的水合物，由硅藻类的遗骸在海底堆积而成。它的吸附力极弱，但有大量的空腔，因此可以作分配薄层色谱中的惰性支持剂（担体），用来分离亲水化合物。薄层用硅藻土粒度在60毫微米以内，商品硅藻土有不加粘合剂的硅藻土H，加石膏粘合剂的硅藻土G，含有荧光物质的硅藻土GF254。（4）其它无机物质：除以上三种常用的无机吸附吸附剂外，还有一些吸附剂，如硅酸镁、硅酸钙、碳酸锌、玻璃粉等。这些吸附剂仅用于某些特殊的用途，而不如硅胶、氧化铝广泛应用。（二）无机静相物质：（1）聚酰胺粉：聚酰胺为内酰胺的多聚体，其分子内存在着很多酰胺键，可与酚类、酸类等化合物形成氢键，酰胺键内的胺基又可与芳香硝基及醌式化合物中的醌基形成氢键，因此对这些化合物产生了一定的吸附作用，这些化合物与聚酰胺形成氢键能力各不相同，故用聚酰胺薄层板可达到分离效果。聚酰胺特别适用于分离酚类化合物，在分析食品中的色素，防腐剂等均有应用。聚酰胺的粘着能力比其它吸附剂差，故需加入纤维素或淀粉等粘合剂。（2）纤维素：纤维素是含有大量的1，4葡萄糖甙链连接的纤维二糖，由於它含有大量的羟基，使得纤维素有良好的亲水性，因此适用于分离亲水性化合物。纤维素薄层板属于分配色谱。纤维素薄层板与纸色谱中的滤纸类似，所不同的主要是薄层用纤维素较滤纸纤维素为短。一般用纤维素长度在2200毫微米之间。其比表面积约为1500厘米/克。由於纤维短。故在纤维素薄层板上展开时扩散很小，形成的斑点致密，可以在较短的距离内得到与纸色谱相同的分离效果，因此展开时间较纸色谱为短。但与无机吸附剂比，展开时间又相对较长，此外也存在不能使用腐蚀性显色剂的缺点。薄层用纤维素有三种类型：1）天然纤维素：由棉花制成，商品称MN-300，MN-300VU254加荧光物质的纤维素），MN-300HR（高纯MN-300）。2）结晶纤维素：由盐酸水解天然纤维素而得，商品称Aviecl。3）乙酰化纤维素：这种乙酰化的纤维素可供反相色谱用，商品有称MN-300AC。（3）离子交换纤维素：在离子交换薄层色谱中，常用的静相物质为离子交换树脂及离子交换纤维素，后者是将天然纤维素经过酯化、醚化，使纤维中的羟基与一些酸性或碱性基团作用，形成有离子交换性质的纤维素，这些物质对於高分子量化合物的分离效果很好，常用离子交换纤维素及离子交换树脂见表31及表32。表31常用离子交换树脂树脂类型名称树脂性质离子型交换容量强酸性阳离子交换树脂Amberlite IR-120Dowex 50Zeokarb 225聚苯乙烯；-SO3-H+聚苯乙烯；-SO3-H+聚苯乙烯；-SO3-H+H或NaH或NaH或Na424350弱酸性阳离子交换树脂Amberlite IRC-50聚丙烯酸；聚甲丙烯酸H100强碱性阳离子交换树脂Amberlite IRA-400Amberlite IRA-410Dowex 1Dowex 2季胺CH2-N（CH3）2CH2CH2OH聚苯乙烯；-CH2-N（CH3）3-CH2-N（CH3）2CH2CH2OHCICICICI33313333弱碱性阴离子交换树脂Amberlite IR-4BAmberlite IR-45Dowex 3聚胺；-NHR，-NR2聚苯乙烯；-NHR，-NR2聚苯乙烯；-NHR，-2NROHOHOH1005055表3-2 常用离子交换纤维素粉树脂类型交换基团化学式名称缩写符号强酸性阳离子交换树脂-O-CH2-SO3-O-CH2-CH2-SO3-磺甲基磺乙基SMSE弱酸性阳离子交换树脂-O-CH2-COO-羟甲基CM强碱性阴离子交换树脂-O-CH2-CH2-N（C2H5）3三乙胺基乙基TEAE弱碱性阴离子交换树脂-O-CH2-CH2-NH（C2H5）2-O-CH2-CH2-NH2-N（CH2-CH2OH）3二乙胺基乙基胺基乙基三乙醇胺DEAEAEECTEOLA（4）亲水性凝胶：多聚葡萄糖凝胶为这一类物质的代表，为一种多联多聚葡萄糖，广为应用在凝胶过滤薄层色谱，商品名称为Sephadex。根据这种凝胶的分子量，把Sephadex分为11种规格，如表3-3所示，一般在G-10至G-25不适于薄层色谱用；在G-50以上可适用于薄层色谱用。粒度比柱色谱所用为细，在10-40微米之间。另外生物胶P（BiogelP）也应用在薄层色谱方面。（5）其他有机物质；淀粉、蔗糖、甘露醇等有机化合物也曾用在薄层色谱上，但已少有应用。表3-4 常用静相物质的一般性质名称酸碱性吸附活性分离原理硅胶氧化铝硅藻土硅酸镁氢氧化钙磷酸钙氢氧化铁活性碳纤维素聚酰胺离子交换纤维素多聚葡萄糖胶酸性碱性中性碱性微碱性中性中性碱性-酸性强强无弱弱强强强无无无无吸附；分配吸附；分配分配吸附吸附吸附吸附吸附分配离子交换凝胶过滤第二节 粘合剂及其他附加剂根据薄层色谱的特点，静相物质通常是粘着在完全惰性的的玻璃板上，而单纯的吸附剂在玻璃板上粘着是很困难的，故往往需要加入适当的粘全剂，增进薄层的机械强度及在玻璃板上的粘着能力。另外根据其他的目的，如显谱、分离等，又往往要在吸附剂内加入一些必要的物质，如荧光剂、酸碱溶液等。现就一些常用的粘全剂及附加剂分别介绍如下。（一）粘合剂（1）煅制石膏：煅制石膏为薄层色谱中用得最多的一种无机粘合剂，粘全力中等。它是由含二分子结晶水的硫酸钙（CaSO4。2H2O）加热1204小时失水而成，失水后的煅制石膏为含半分子结晶不的硫酸钙（CaSO4。1/2H2O）。另热过程中如如温度过高则进一步失水，到200以上则完全失水而成无水硫酸钙，并失去可凝固性。煅制石膏与少量水结合时，逐渐硬化并膨胀。以石膏为粘合剂的吸附剂有硅胶、氧化铝及硅藻土。石膏含量在515%之间。商品称硅胶G、氧化铝G及硅藻土G。以石膏为粘合剂的优点是不与被分离化合物及显色剂起化学反应，并可使用腐蚀性显色剂。其缺点是粘合力不强，薄层的机械强度较差，容易破裂。但这种粘合力不强的性质，对于薄层的洗脱含量测定及制备薄层色谱又是有利的条件。（2）淀粉：粘合力中等，但较石膏为强，其据点是容易受到腐蚀性显色剂和与淀粉起化学反应的显色剂的干扰，配制方法也比石膏麻烦。（3）其它粘合剂：聚乙烯醇、竣甲基纤维素都有可以做薄层的粘合剂。后都有的粘合力强，制成的薄层板机械强度好，耐磨，而且制备简单。但不易取下，影响洗脱含量测定。（二）附加剂：（1）荧光物质：在薄层色谱中，荧光猝灭法是一种常见的方法，应用这种方法，需要在吸附剂中加入一些荧光物质。常见的有硫化镉、硅酸锌等。含有荧光物质的薄层板，在短波紫外线（254nm）照射下，产生绿色荧光，而被分离的化合物因荧光猝灭而产生绿色斑点。加有这种荧光物质的薄层板，商品称为硅胶GF254，氧化铝GF254。此外加入罗丹明6G荧光物质的薄层板，在长波紫外线（366nm）的照射下，板底呈蓝色荧光，商品称为硅胶GF366。（2）其它吸附剂：根据被子分离物质的特殊需要，如增进分离效果、提高反应灵敏度等，可加入适当的吸附剂。如在吸附剂中加入硼酸，可以增进碳水化合物异构体的分离，因为硼酸可以与这些异构体形成络合物；加入硝酸银的薄层板，有助于分离不饱合化合物。又如用稀酸或稀碱代替蒸馏水制板，前者称酸性薄层板，可以分离酸性物质，如酚类、有机酸；后者称碱性薄层板，可分离有机碱及有机胺。第三节 动相溶剂薄层色谱中展开溶剂的选择，对於成功地进行薄层分离是非常重要的。因为在吸附剂、被分离物质及展开溶剂三因素中，前二者的性质在一定条件下是固定的，所以展开溶剂的性质将对薄层分离效果有重要影响。在用硅胶、氧化铝及其他无机吸附剂进行吸附薄层色谱分离时，溶剂系统选择的原则与吸附柱色谱类似。其中最重要的是展开溶剂的极性。一般说来，中等极性的被分离物质，需用中等活性的吸附剂及中等极性的展开溶剂；非极性的被分离物质，需要用高度活性的吸附剂及非极性展开溶剂；极性的被分离物质，用低活性的吸附剂及强极性的展开溶剂。展开溶剂的选择要考虑到被分离物质极性的强弱，而这种极性与化合物结构有相当密切的关系。各种官能团的极性，按下列顺序递增。-CH2-CH2-CH=CH-OCH3-COOR=C=O-CHOSH-NH2-OH-COOH各种溶剂的极性顺序各资料介绍略有出入，表（3-5）供参考。为了选择最佳的展开溶剂，通常多采用两种或两种以上的混合溶液剂系统。这种溶剂由“基础溶剂”及“洗脱溶剂”二部分组成。基础溶液剂常用极性小的溶剂，如正已烷、石油醚、苯、四氯化碳、氯仿等；洗脱溶液剂多用极性强的溶液剂，如丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙脂等。表（3-6）为几种常见的二元溶液剂系统，可以看出洗脱溶剂增加所引起的极性改变。图3-4是以四氯化碳为基础溶剂，乙酸乙酯为洗脱溶剂所组成的二元溶剂系统在按不同比例混合时，对四种有机硫代磷本酯类杀虫剂在薄层板上分离的hRf值的影响。在用纤维素、硅藻土等进行分配薄层色谱分析时，溶剂的选择原则与纸色谱法相同。主要取决於被分离化合物在展开溶剂及静相中的溶解度比，即分配系数。在用聚酰胺为吸附剂时，按在溶剂中形成氢键能力的强弱，排列溶剂顺序如下：水乙醇甲醇丙酮稀碱（氢氧化铵或氢氧化钠）甲酰胺二甲基甲酰胺薄层色谱中展开溶剂的选择，可采用以下两种简单的预试法：（一） 微薄层法：用普通的显微镜戴玻片，涂上吸附剂，活化后在底边点样，并在染色缸中展开5厘米，取出吹干后显色。若混合物能分离为各个单独的色斑，则展开溶剂可用。（二） 微量圆环法：将样品溶液点在薄层板上，可同时点数点，每点间距2-3厘米。再用毛细管分别吸取待试展开溶剂，依次滴加在各样品原点中，干后显色。如某种溶剂将待分离混合物形成一个个分离明显的同心圆环，则为较合适的展开溶剂。表3-6混合溶剂的极性顺序洗脱能力环已烷苯环已烷：乙酸乙酯（95+5）苯：乙酸乙酯（95+5）氯仿环已烷：乙酸乙酯（85+15）苯：乙酸乙酯（85+15）氯仿：丙酮（9+1）苯：甲醇（95+5）环已烷：乙酸乙酯（1+1）苯：乙醇（9+1）氯仿：丙酮（85+15）苯：乙酸乙酯（1+1）环已烷：乙酸乙酯（1+4）乙酸乙酯乙酸乙酯：甲醇（99+1）苯：丙酮（1+1）丙酮二甲基甲酰胺二甲基甲砜第四章 薄层色谱操作技术第一节 薄层板的的制备及性质薄层板的制备是将吸附剂涂布在大小适当的戴板上，形成一定厚度的薄膜。制备一定规格的薄层板，是保证获得满意的分离效果及良好的Rf值重现性必不可少的条件。具体制备方法及有关问题分别讨论如下：（一）载板：戴板应对各种展开溶剂、化学显色试剂以及温度都具有稳定性，同时又应有一定的机械强度以便重复使用。常用的戴板中，以玻璃最好，一般玻璃只要表面平整光滑，厚度在24厘米，允差0.10.2毫米即可。戴板大小无绝对规定，由斯塔尔推荐的标准规格为2020厘米、2010厘米。作为一般简单的快速薄层分离，也可用显微镜戴玻片作戴板。至于制备薄层色谱，所用戴板可达20100厘米。戴板应非常干净，才能保证良好的粘着效果。故玻板应先用肥皂水洗净，再在重铬酸洗液内浸泡，然后清洗干净，最后用蒸馏水淋洗，晾干后备用。玻璃板的缺点是不易保存。其他材料的戴板中，最常用的为塑料板。塑料戴板制备薄层板操作复杂，因此多为成品薄层板出售。其优点为使用简便，缺点为高温下抗腐蚀性差。其他如不锈钢板也有应用。（二）吸附剂糊的配制：在选择好适当的戴板后，应根据需要，制备一定粘度的吸附剂匀浆供制备薄层板用。常用各种吸附剂糊的调制方法如下：（1）硅胶1）加石膏粘合剂：取硅胶G20克，置于玻璃乳钵中，将40毫升蒸馏水分两次加入，第一次加入3035毫升，充分研磨后，再加入剩余的水。迅速小心研磨，直至开始出现凝胶状，立即铺板。吸附剂的加水量和加水后的搅拌时间相当重要，是制备薄层板成败的关键。若加水量过多，则吸附剂不易胶化；过少则胶化过快造成涂布困难。搅拌时间无具体规定，一般在4565秒左右，以吸附剂开始出现凝胶状态时为佳，此时粘度增大，光泽洁白；超过此时则凝胶固化，不易涂布。目前不同厂牌及批号的吸附剂加水量及搅拌时间都有所不同，可以根据具体情况选择最佳条件。（其他无机吸附剂如氧化铝G、硅藻土G的制备方法与硅胶G相似）2）加淀粉粘合剂：一般是在吸附剂中加入约5%的淀粉及二倍量的水，在沸水浴上加热，不断搅拌至呈一定的粘稠度，进行铺板。3）加羟甲基纤维素粘合剂：通常取硅胶55克或氧化铝6080克，加1%羟甲基纤维素水溶液100毫升，调成糊状，进行铺板。（2）纤维素粉1）天然纤维素粉：配成15%的纤维素水悬浮液，在电磁搅拌器上混合3060秒钟，纤维素粉不需加任何粘合剂，即可铺板。2）微结晶纤维素粉：配制成15%30%的水悬浮液，电磁搅拌器上充分混合1分钟，即可铺板。搅拌过久可能形成凝胶而失败。3）乙酰化纤维素粉：根据纤维素乙酰化的程度不同，称取适量，加95%乙醇，充分搅拌后铺板。（3）聚酰胺粉取聚酰胺粉12克，加甲醇50毫升，用力充分振摇后铺板。若加入2。5克纤维素粉及40毫升甲醇，在电磁搅拌器上混合成浆，可制成坚固的薄层板。（4）离子交换剂1）离子交换树脂：取5克纤维素MN300加少量水搅拌几分钟，再加2030毫升蒸馏水，继续搅拌，加30克Dowex50树脂，最后加25毫升水，铺板。2）离子交换纤维素：用蒸馏水配制成1020%离子交换纤维素，按一般吸附剂铺板法进行铺板，粘着效果良好。（三）薄层板制备：薄层板的制备方法，目前常用的有浸渍法、倾注法、喷雾法及涂布法。其中最常用的方法为涂布法。各法简述如下：（1）浸渍法：用于小型薄层板的制备，如戴玻片板。所用的吸附剂糊，最好用有机溶剂来配制，如氯仿-丙酮或氯仿-甲醇混合液。将两张玻片背靠背地贴紧，放在吸附剂糊中浸渍，取出后放在水平板上，即可在玻片上形成薄层。（2）倾注法：与浸渍法类似，操作简便，不需特殊仪器。将一定量的吸附剂糊，均匀地倾注在玻片上，再入置水平板上，使其形成厚度较为均匀的薄层。（3）喷雾法：采用气体压力喷雾方法，将吸附剂糊均匀地喷洒在玻片上，形成一层薄层。（4）涂布法：本法为实验室最常用的薄层板制备法。薄层涂布器由涂布台及涂布仪二者组成，有商品出售。也可以自制，基本结构如图41，材料可用不锈钢或有机玻璃。图42为一种自制的简易涂布器。这种涂布器有一个活动的闸板，涂布时吸附剂从闸板下的缝隙流出，涂在载板上。根据薄层厚度的要求不同，可制成多种规格缝隙的闸板，以便调换。一般有250、275、500、750、1000和2000微米等规格的闸板。商品涂布器种类较多，最常用的为斯塔尔型涂布器。涂布法制备薄层板易精确控制厚度，是其最大的优点。其他三种方法都具有不易控制薄层厚度的缺点。（四）薄层板的活化与贮存：吸附薄层色谱的薄层板，首先应具有一定的吸附活性，才能达到良好的分离效果。薄层板的活度与吸附剂中水份含量有关，水份含量高，则活度减弱。因此，为达到某一规定的吸附活度，就应加温除去薄层中的水份。这一过程称为薄层板的活化，其操作为：将涂布后的薄层板在常温下放置1520分钟，使水份蒸发、吸附剂凝固。这一过程中薄层板有如下现象：（1）开始薄层板表面有闪亮光泽。（2）几分钟后光泽消失。（3）最后薄层凝固，颜色变白，水份蒸发约50%。薄层板的活度级可用标准色素测定，其方法如下：（1）硅胶薄层板的活度测定：称取标准色素奶油黄、苏丹红及靛酚蓝各40毫克，溶于100毫升苯中，将此混合溶液点于已活化的薄层板上，用正已烷或石油醚展开10厘米，所有色素均应停留在原点；而用苯展开10厘米时，则应分离成三个清晰的斑点。其Rf值应分别为：奶油黄0.58，苏丹红0.19，靛酚蓝0.08。而且展开溶剂前沿的上升速度应在30分钟移动10厘米。（2）氧化铝板的活度测定：称取偶氮苯30毫克，对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红及对氨基偶苯各20毫克，分别溶于50毫升四氯化碳中，并各取10微升点于已活化的氧化铝板上，用四氯化碳为展开溶剂，根据标准色素的Rf值（下表），查出其活度级。氧化铝板活度级拜克曼分类法染料名称Rf 值活动级活动级活动级活动级偶氮苯对甲氧基偶氮苯苏丹黄苏丹红对氨基偶氮苯059016001000000074049025010003085069057033008095089078056019薄层板活化后，应立即使用，若特殊情况需要保存时，可在活化后，立即贮存于硫酸干燥器内，以免吸收空气中的水份及某些气体而影响活度。保存时间约一周，不宜过长。（五）烧结薄层板的制备及性质：目前，硅胶和氧化铝薄层板应用较广，但这种薄层板还有不足之处。首先必须临时制备，较为麻烦，而且只能使用一次，吸附剂消耗量大，不够经济；其次这种薄层板非常脆弱，无论在使用或者保存上都不够方便。（六）薄层板质量规格：根据以上各种方法制成的薄层板，其质量应符合下列要求。（1）表观性状：应表面平整、光滑、无印痕和气泡，对光观察均匀。（2）机械强度：薄层板在浸入展开溶剂内及喷洒显色剂等操作过程中，薄层不脱落，加热过程不裂缝。（3）毛细管性能：展开过程中，溶剂前沿应呈一水平线，上升速度适当，250微米厚度的薄层板，用苯展开时，上升10厘米应在3040分钟为佳。（4）薄层厚度：薄层厚度应均匀一致，符合实验要求，分析用薄层板，一般为250500微米，而制备用薄层板为5002000微米。薄层厚度影响动相溶剂展开的速度5。以正已烷-乙酸乙酯（9+1）为展开溶剂，在一规定时间内在不同厚度的硅胶板上展开，结果各板展开的距离不等，见图45。从图中还可以看出在250微米厚度以内，薄层板愈薄，展开速度愈慢。第二节 点样薄层色谱中，点样与色斑的形成有一定关系。要求滴加的样品溶液原点应尽可能小，一般直径不超过3毫米为适宜。对于薄层定量测定，更应使各原点面积大小基本一致。点样的方法有以下两种；（一）直接点样法：首先在薄层板上用硬质铅笔或解剖针，在距底边3厘米或2.5厘米处，轻轻描划出点样的起始线。并根据规定的展开距离（10厘米或12厘米）在薄层板上端画出展开溶剂前沿的到达线。然后用微量注射器或尖端磨细的血色素吸管，直接将样品溶液点加在起始线上，每点之间距离为1.5厘米。点样时可用空气流缓缓吹过点样原点，以便溶剂迅速挥发，原点面积不至过大。微量注射器最适用于薄层色谱的点样。但一般尖针头液滴不易落下，也易搓戳破薄层，故不适用。简单的改进方法可将针头磨平，但如不小心又会使针孔被吸附剂颗粒堵死。对于样品溶液只有10微升以内的点样，手工操作即可，但在10微升以上时，手工点样不可避免地会造成失误，同时也过于劳累、烦琐。故一般是将注射器固定在一个架子上操作。将针尖同薄层板的距离和滴液的速度控制恒定，因此原点大小也可以控制，而且又可以同时点几个样品，故其优点较多。点样时应注意不使针尖将薄层板戳成小孔，以免形成非圆形的不规则色斑。因为如果原点有小孔，在展开时通过原点中心轴的溶剂，将比小孔周围的溶剂慢一些，这样Rf值较高的化合物色斑就呈三角形，而Rf值较低的化合物色斑就呈新月形。若点样溶液体积过大，原点的面积也增大，会影响结果。这种情况，可选择一种能使所有待分离化合物的Rf值都等于1的展开溶剂，先作一短距离展开，此时待分离化合物将沿展开溶剂前沿，形成一个与底边平等行的细线，此线即可作样品的起始线，不过原点不是一个圆点，而是一根细线。对于制备薄层色谱，需要尽可能地增大制备量，点样量就需要增大，因此常采用线状点样，点样体积可达几百微升。薄层点样应力求迅速，一般不超过10分钟。因为薄层板暴露的时间过长，会吸收空气中的水份而改变活度，影响分离效果。因此，点样时要求有纯熟的技术。（二）滤纸移样法：直接点样法，很难使原点面积大小一致，也很难控制直径在3毫米以内，而且又容易损伤薄层的表面，特别是在薄层板上进行测量面积定量时，这些缺点会影响测定结果。滤纸移样法可以克服上述缺点，其操作方法为；用内径为3毫米的皮带冲，将色谱滤纸冲成圆片，用细标本针挑起滤纸圆片，将样品溶液分次缓缓点在圆片上，每次点样后要待溶液完全挥发后再点第二次，如图410所示。加外在薄层板的起始线上，用皮带冲轻压薄层，使薄层形成3毫米的圆孔，孔内放一点糊状淀粉，将点好样的滤纸圆片，仔细放入孔内，使其粘附即可。第三节 展开薄层色谱法的展开方式与滤纸色谱法相似，基本类型可分为上行展开，下行展开及水平展开三种。下行展开法目前少有应用，本节不再介绍。（一）上行展开法：本法为最常应用的一种方法，其展开仪器及方式有以下几种：（1）不饱合展开槽：常用的为长方形标准缸，并附有可严密封口的玻璃盖。展开槽的大小以放下薄层板为宜，不宜过大。首先将展开溶剂倒入槽内，。一般展开高度为距原点1012厘米，根据情况亦可上升至15厘米。由于此法是在不饱合展开槽内，薄层板上的展开溶剂不断一由薄层板上挥发，而挥发的速度由薄层板的中间到两边逐渐增加，因此，溶剂上升的量两边大于中间。所以同一种化合物在同一张薄层板上，所得色斑的Rf值两边较高而中间略低。这一现象称为“边沿效应”。特别是用混合溶剂时，更易出现边沿效应。（2）饱合展开槽：在展开槽的三面内壁围上滤纸，薄层板相对的一面不围滤纸，加入展开溶剂，使溶剂沿滤纸上升，当滤纸完全为溶剂润湿时，溶剂由滤纸表面挥发，槽内就为展开溶剂蒸气所饱和，此时放入薄层板进行展开。由于槽内充满溶剂蒸气，薄层板上的溶剂不再挥发，因此可以消除边沿效应。在饱合槽内展开，比在不饱合槽内展开快，Rf值的重现性也较好。（二）水平展开法：常用的水平展开有两种方式。其一如图416，在一扁平玻璃槽内，一端放一卷有滤纸的玻棒，另一端放一不卷滤纸的玻棒，立即加盖，此时展开溶剂沿滤纸流向薄层板展开。此法目前已少有应用。另一种为环状薄层展开法，原点点在薄层板的中间，通过棉花的毛细作用，使溶剂上升到薄层以上，向四周呈环状展开（三）楔形展开法：用不锈钢刀把薄层板表面刮成楔形，展开时，溶剂通过原点后，就呈放射状扩散，随展开溶剂的扩散，被分离的化合物形成弧状。这种展开技术分离容量大，适用于Rf值接近，分离较难点的混合物。（四）双向展开法：纸色谱中常用的双向展开法，对于分离复杂的天然混合物是非常成功的，这种展开法也适用于薄层色谱。以双向展开中，通常用2020厘米的标准规格的薄层板。将样品点在薄层板的一角，距两边各2厘米处，按一般上行法用溶剂I展开一次，取出薄层板，挥干溶剂，须时针方向转动90，即在原来展开方向垂直的一边，用溶剂再展开一次。由于两种溶剂分离效能不同，被分离的混合物将分布在方形薄层板上。（五）梯度展开法：柱色谱中的梯度淋洗法，也可应用在薄层色谱的展开中。这种展开方法是在展开过程中，不断改变混合溶剂中的百分比组成，从面增进分离效能，同时又可消除其它展开法出现的拖尾现象。展开仪器如图420，首先在展开槽内注入基础溶剂I，然后再进溶剂管（3）处以匀速加入另一溶剂，并经搅拌器