过氧化氢与硫化氢在乙烯调控拟南芥气孔关闭过程中的相互关系.doc

青岛农业大学毕 业 论 文（设计） 题 目：H2O2与H2S在乙烯调控拟南芥气孔关闭 过程中的相互关系 姓 名： XXXXXXX 学 院： 生命科学学院 专 业： 生物技术 班 级： 休息休息 学 号： XXXXXXX 指导教师： XXXXXXXX 2011 年 6月 21日目 录中文摘要.1Abstract.2引言.41 材料与方法.71.1 材料.71.2 方法.71.2.1 气孔开度的测定.71.2.2 保卫细胞胞内H2O2的检测.71.2.3 拟南芥叶片H2S含量的测定.71.2.4拟南芥叶片L/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定.82 结果与分析.92.1 H2O2参与乙烯对气孔运动的调控.92.1.1 乙烯诱导气孔关闭.92.1.2 H2O2清除剂和合成抑制剂对乙烯诱导气孔关闭的影响.92.2 H2S参与乙烯诱导气孔关闭过程.102.3 H2O2与H2S在乙烯诱导气孔关闭过程中的相互关系.102.3.1 H2O2位于H2S上游参与乙烯诱导气孔关闭的可能性.102.3.1.1 H2O2清除剂及合成酶抑制剂对乙烯调控的拟南芥叶片H2S含量的影响.102.3.1.2 H2O2清除剂及合成酶抑制剂对乙烯调控的拟南芥叶片H2S合成酶活性的影响.112.3.1.3乙烯对拟南芥H2O2合成突变体叶片H2S含量的影响.122.3.1.4乙烯对拟南芥H2O2合成突变体叶片H2S合成酶活性的影响.122.3.2 H2O2位于H2S下游参与乙烯诱导气孔关闭的可能性.132.3.2.1 H2S清除剂及合成酶抑制剂对乙烯调控的拟南芥保卫细胞H2O2含量的影响.132.3.2.2乙烯对拟南芥野生型及H2S突变体保卫细胞H2O2含量的影响.143 讨论.15致谢.16参考文献.17H2O2与H2S在乙烯调控拟南芥气孔关闭过程中的相互关系生物技术专业 XXXXX 指导教师 XXX教授摘要：以拟南芥野生型、H2S合成突变体（Atl-cdes和Atd-cdes）和H2O2合成突变体（Atpao2, Atpao4, AtrbohF, AtrbohD）为材料，综合应用植物生理学和激光共聚焦显微技术，结合药理学实验观测乙烯对气孔运动的影响，检测处理前后气孔保卫细胞H2O2和叶片H2S含量及其相关酶的变化，从组织水平、细胞水平和遗传水平为H2S和H2O2参与乙烯调控气孔运动的信号转导过程提供实验证据，并探讨二者的相互关系。结果表明，在一定浓度范围内，乙烯利可诱导拟南芥气孔关闭；H2O2的清除剂（ASA和CAT）和合成抑制剂(DPI和SHAM)可抑制乙烯诱导气孔关闭的效应，且乙烯利能够引起气孔保卫细胞胞内H2O2的升高；H2S主要合成酶L/D-半胱氨酸脱巯基酶的抑制剂AOA、NH2OH，及其产物C3H3KO3+NH3均可不同程度的减弱乙烯利诱导气孔关闭的作用；同时，乙烯利可诱导拟南芥野生型叶片H2S含量及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性升高。由此证明H2S和H2O2均参与乙烯调控气孔运动，而且在乙烯诱导气孔关闭过程中H2S主要来自L/D-半胱氨酸脱巯基酶途径，H2O2主要来自NADPH氧化酶和细胞壁过氧化物酶途径。同时发现，乙烯利可诱导拟南芥及H2O2合成突变体叶片中H2S含量及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性升高；H2S的合成酶抑制剂AOA、NH2OH以及C3H3KO3+NH3都不能明显抑制乙烯诱导的保卫细胞中H2O2水平的增加；但乙烯利能够明显增加拟南芥野生型和H2S合成突变体Atlcdes和Atd-cdes气孔保卫细胞的H2O2水平。由此推测，在乙烯诱导气孔关闭过程中H2S位于H2O2的下游。关键词：过氧化氢；硫化氢；乙烯；气孔关闭；拟南芥The Relationship Between H2O2 and H2S Involved In Ethylene Induced Stomatal Closure In Arabidopsis thaliana L. Student majoring in biotechnology XXXXXTutor XXXXXAbstract: Through pharmacological combined with laser scanning confocal microscope (LSCM) and spectrophotography to study the role of H2S and H2O2 in signaling during Arabidopsis thaliana stomatal movement response to ethylene. We explored the relationship between H2S and H2O2 involved in ethylene induced stomatal closure in Arabidopsis from the cell level, the tissues level and the genetic level.The results showed that treatment with ethylene resulted in a dose-dependent stomatal closure in Arabidopsis; AsA, CAT the scavenger of H2O2 and SHAM, DPI, the inhibitors of H2O2 synthesis, and AOA, NH2OH and C3H3KO3+NH3, the inhibitors of H2S synthesis, all reduced ethylene-induced stomatal closure. At the same time, ethylene was shown to enhance H2S content in leaves and the activities of L-/D-cysteine desulfhydrase. We can conclude that H2S and H2O2 were both involved in the signal transduction pathway of ethylene-induced stomatal closure in Arabidopsis, and in this process, H2S was mainly derived from L/D-cysteine desulfhydrase, and H2O2 was mainly derived from NADPH oxidase and cell wall peroxidase. Ethylene induced content of H2S and L/D-cysteine desulfhydrase activity increased in H2O2 mutant； AOA, NH2OH and C3H3KO3+NH3, H2S synthesis inhibitors can not significantly inhibit the level of H2O2 in guard cells which was increased by ethylene; ethylene can significantly increase the level of H2O2 of the guard cell in the wild type and Atl-cdes and Atd-cdes. H2S may represents a novel downstream component of H2O2 signaling cascade during ethylene-induced stomatal movement in Arabidopsis thaliana.Key words: hydrogen peroxide; hydrogen sulfide; ethylene; stomatal; Arabidopsis thaliana L.缩略词对照表缩写英文名称中文名称H2O2hydrogen peroxide过氧化氢H2Shydrogen sulfide硫化氢AOAaminooxyacetic acid氨基氧乙酸SHAMsalicylhydroxamic acid水杨羟肟酸DPIdiphenyl iodine二苯基碘L-CDesL-cysteine desulfhydraseL-半胱氨酸脱巯基酶D-CDesD-cysteine desulfhydraseD-半胱氨酸脱巯基酶-HEH -hydroxyethyl hydrazine -羟基乙基肼DADD didodecyldithio-oxamide十二烷二胺NH2OHhydroxylamine羟胺AsAascorbic acid 抗坏血酸CATcatalase 过氧化氢酶引 言气孔是高等植物与外界环境进行水分和气体交换的重要门户，植物的保卫细胞结构简单，容易受到外界环境中水分、激素等不同因素的影响，从而调节气孔的开闭状况，进一步调节叶片的蒸腾作用和光合作用，最终影响植物生长。业已证明，乙烯和脱落酸等能够诱导气孔关闭（Jung等，2008），但是具体的调控气孔运动的信号转导机制、信号成员组分及信号分子之间的关系还没有完全弄清楚。因而，气孔运动的研究一直受到人们的重视，其运动机制一直是人们普遍关注的问题。乙烯是五大类植物激素中最为简单的、并且是唯一的气态物质，在植物生长和发育过程中发挥着重要作用。根据研究报道，乙烯和气孔运动也有着密切的联系。例如，乙烯可以诱导番茄、康乃馨（Madhavan等，1983）拟南芥（Desikan等，2006）和蚕豆（Vicia faba L.）（刘国华等，2009）气孔关闭；乙烯与水杨酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）在调控蚕豆气孔运动中存在协同作用（刘新等，2000）；2006年Desikan实验证明乙烯诱导气孔关闭需要保卫细胞和叶肉细胞之间的交流。在乙烯诱导气孔关闭的过程中有钙和H2O2等第二信使的参与（刘国华等，2009）。1 H2S在植物体内的来源和作用图1 内源性H2S气体产生示意图（Kimura等，2002）Fig. 1 H2S synthesis in plants硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）曾经一度被认为是污染环境的毒性气体，后来发现硫化氢在动物体内可以快速运输来调节多种生理过程，证明内源硫化氢在不同的器官中产生（Wang等，2002），2007年Szabo等证明在有炎症的地方同样也会产出硫化氢。在许多哺乳动物中H2S可以诱导DNA的降解，并且改变细胞周期；可以参与和大脑发育及调节神经活动相关的活动（Tan，2010）；证明硫化氢在治疗炎症过程中发挥着积极的作用。近期越来越多的实验表明，H2S是除一氧化氮（nitric oxide，NO）和一氧化碳（carbon monoxide，CO）之外的第三种新型气体传递信号分子，H2S在植物体内也同样发挥着重要的作用。在植物体硫化氢可能有两种存在方式， 其中2/3的H2S解离成H+和HS-。Sekiya等（1982）研究发现在体内NaHS可以解离成Na+和HS- 并且在这两者之间形成一个动态平衡。植物体内H2S合成途径主要有酶促途径和非酶促反应途径，酶促途径是通过半胱氨酸脱巯基酶分解半胱氨酸成硫化氢（图1）。1980年Harrington等报道，L-半胱氨酸可以在L-半胱氨酸脱巯基酶的作用下释放H2S，紧接着又相关有报道表明D-半胱氨酸可以在D-半胱氨酸脱巯基酶作用下生成H2S等产物。 随着对硫化氢在动物体内生理作用的不断深入研究，H2S在植物内的生理作用也越来越引起研究人员的重视。首先是Stuiver等（1992）和Dan等（2007）分别证明外施H2S可以提高小麦幼苗的耐寒性和低浓度H2S胁迫会抑制侧根生长。随后Zhang等（2009）实验证明外源硫化氢提高植株的抗氧化胁迫的能力。特别是关于硫化氢参与气孔调控研究近几年也是逐渐增多，如2005年Riemenschneider等人实验发现硫化氢可以作为信号分子参与拟南芥中巯基含量的调控。2010年Garca-Mata和Lamattina等人以蚕豆、拟南芥和凤仙花为材料，证明H2S参与ABA诱导气孔关闭信号转导途径。2 植物体内H2O2的作用过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）是细胞正常代谢活动的产物。当植物在受到生物及非生物胁迫时，能诱导H2O2的产生，进一步调控一系列胁迫响应的信号转导。植物细胞可以通过多条途径产生H2O2，除了电子传递过程中产生的H2O2外，H2O2还可以由质膜上的 NADPH氧化酶，细胞壁中的多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）和细胞壁过氧化物酶等途径合成。H2O2在植物体内的作用一直引起人们的关注，Neill和Desikan （2002）研究证明H2O2可以在植物内作为调节胁迫的信号分子。Fan等（2008）和张立军等（2008）分别证明H2O2 参与NO诱导的番茄抗病机制和低温胁迫条件下外施H2O2处理大豆种子能够诱导过氧化氢酶（catalase，CAT）和过氧化物酶（peroxidase，POD）等活性增加。在参与气孔调控研究方面，Srivastava等（2009）对H2O2产生来源的研究结果表明，由NADPH氧化酶途径合成H2O2参与壳聚糖诱导气孔关闭的过程，同时证明H2O2介导了其他因子对气孔运动的调控。如，ABA诱导气孔关闭过程中有H2O2的迅速积累（Desikan等，2004）。刘国华等（2009）实验证明来自NADPH氧化酶及细胞壁过氧化物酶的H2O2参与了乙烯诱导拟南芥气孔关闭的过程，随后有证明了在乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程中NO位于H2O2的下游。越来越多的实验证明H2S和H2O2都可以作为信号分子参与动植物的生理过程。近几年关于两者在生理调控中的关系的研究也是在逐渐的增多。Eto等在2002年证明了H2S可能抑制由于H2O2引起的活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多而引起的抗氧化应激损伤。随后2004年Geng等人以动物为实验材料研究证明一定浓度的H2S可直接清除H2O2，保护心脏免受异丙肾上腺素损伤。紧接着Muzaffar等在2008年研究发现H2S可增加NADPH/NADP比例。在植物方面，关于两者作用关系的研究鲜有报道，侯智慧等（2011）研究发现H2S可能作为H2O2的下游信号介导茉莉酸诱导的蚕豆气孔关闭。3 研究目的和意义H2S作为一个新型的信号分子参与了动植物中较多生理过程，但是在植物调控气孔运动方面鲜有报道。本实验室前期的实验已经证明参与来自NADPH氧化酶及细胞壁过氧化物酶的过氧化氢参与了乙烯诱导拟南芥气孔关闭的过程。但是对于两者在乙烯诱导拟南芥气孔关闭这一过程的相互关系并不明朗。本实验以拟南芥野生型、H2S合成突变体（Atl-cdes和Atd-cdes）和H2O2合成突变体（Atpao2, Atpao4, AtrbohF, AtrbohD）为材料，综合应用植物生理学和激光共聚焦显微技术，结合药理学实验观测乙烯对气孔运动的影响，检测处理前后气孔保卫细胞H2O2和叶片H2S含量及其相关酶的变化，从组织和细胞水平为H2S和H2O2参与乙烯调控气孔运动的信号转导过程提供实验证据，并探讨二者的相互关系，以期为全面了解H2S和H2O2在乙烯调控气孔运动过程中具体作用提供初步的实验证据，其研究成果有利于理解乙烯调控的保卫细胞气孔运动机制。1 材料与方法1.1 材料 拟南芥野生型（Arabidopsis thaliana L.）、H2S合成突变体（Atl-cdes和Atd-cdes）和H2O2合成突变体（Atpao2, Atpao4, AtrbohF, AtrbohD）。将野生型及突变体种子经10% NaClO灭菌15 min，无菌水冲洗5次后，点种于无菌MS固体培养基，4下处理2-4 d打破休眠，转入光照培养箱（22 ，光周期16 h/8 h）垂直生长约一周，转入到培养土（市售花卉营养土）和蛭石按体积比1:1混合的培养介质中，于光/暗周期16 h/8 h，温度18 -22 ，光强120 mol/m2s，相对湿度70 %下培养，4-5周后取生长良好拟南芥完全展开的莲座叶供实验用。主要试剂：H2O2荧光探针4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2DA)、乙烯利 (ethephon，Eth)、羧甲氧基胺半盐酸盐（aminooxy acetic acid，AOA）、丙酮酸钾（potasium pyruvate，C3H3KO3）等药理学试剂均购于Sigma公司（U.S.A）；N,N-二甲基-对苯二胺（N,N-dimethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride）购自Fluka公司（U.S.A）；-羟基乙基肼（-hydroxyethyl hydrazine，-HEH）、十二烷二胺（didodecyldithio-oxamide，DADD）、抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）、水杨羟肟酸（salicylhydroxamic acid，SHAM）、二苯基碘（diphenyl iodine，DPI）、羟胺（hydroxylamine，NH2OH）等其余化学试剂均为国产分析纯。1.2.1 气孔开度的测定取生长良好4-5周龄拟南芥完全展开的莲座叶，光诱导使气孔张开。撕取其下表皮，小心刷涂上面粘附的叶肉细胞，用不同处理液(乙烯利分别与-HEH，DADD，AsA， SHAM，DPI共处理)进行处理，在光下(光强200 mol/m2s)处理30 min。用显微测微尺测量气孔的初始孔径，测量时，随机取3个视野，每个视野内随机取10个气孔。每个处理重复3次，取3次重复的平均值和标准误差。1.2.2 保卫细胞胞内H2O2的检测使用特异性荧光探针H2DCF-DA检测保卫细胞内的H2O2。取生长良好4-5周龄拟南芥完全展开的莲座叶，撕取其下表皮，放入表皮条缓冲液中，光诱导3 h使气孔完全张开，后将其置于处理液(乙烯利、乙烯利分别与HT，AOA和NH2OH以及C3H3KO3+NH3共处理)中处理。处理后加入50 mol/L H2DCF-DA(Sigma，德国)25 下避光孵育20 min，孵育完毕后用表皮条缓冲液冲洗3次，除去吸附的染料。将处理好的表皮条置于载玻片上，盖好盖片，用488 nm蓝光激发，发射波长在505-530 nm之间，经激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM 510 META)扫描，获得气孔保卫细胞细胞中H2O2的静态分布图像1.2.3 拟南芥叶片H2S含量的测定拟南芥叶片H2S含量的测定参照Sekiya等（1992）的亚甲基蓝法并稍作修改。剪取生长良好4-5周龄拟南芥完全展开的莲座叶，用蒸馏水洗脱1 h后，乙烯利、乙烯利分别与-HEH，DADD，AsA，SHAM，DPI共处理4 h后，取0.1 g叶片加0.9 mL 20 mmol/L TrisHCl （pH 8.0）匀浆，离心取上清用于检测，蛋白浓度为100 g/mL。将装有醋酸锌的吸收井放入装有上清的小测试管内（1275 mm），加入100 L 30 mmol/L FeCl3（溶于1.2 N HCl）和100 L 20 mmol/L N,N-二甲基-对苯二胺（溶于7.2 N HCl）,将测试管用封口膜迅速封好，37 C反应30 min，在670 nm波长下，测定吸光度值。1.2.4拟南芥叶片L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定参照Riemenschneide等（2005）的方法。剪取生长良好4-5周龄拟南芥完全展开的莲座叶，用蒸馏水洗脱1 h后，乙烯利、乙烯利分别与-HEH，DADD，AsA，SHAM，DPI共处理4 h后取0.1 g叶片加0.9 mL 20 mmol/L TrisHCl（pH 8.0）匀浆，离心取上清用于检测，蛋白浓度为100 g/mL。L-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定是通过测定L-半胱氨酸（含DTT）释放的H2S来测定的。1 mL的反应体系包括：0.8 mmol/L L-半胱氨酸，2.5 mmol/L DTT，100 mmol/L TrisHCl（pH 9.0）和10 g蛋白溶液。加入L-半胱氨酸后置于37 C反应30 min，最后加入100 L 30 mmol/L FeCl3（溶于1.2 N HCl）和100 L 20 mmol/L N,N-二甲基-对苯二胺（溶于7.2 N HCl）终止反应，在670 nm波长下，测定吸光度值。D-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定除了将L-半胱氨酸换成D-半胱氨酸，以及TrisHCl为pH 8.0外其余与L-半胱氨酸脱巯基酶活性的测定完全相同。对照和处理都是3次重复的平均值。2 结果与分析2.1 H2O2参与乙烯对气孔运动的调控图1乙烯对拟南芥叶片气孔运动的影响Fig. 1 Effects of ethylene on stomatal movement in leaves of Arabidopsis thaliana L.2.1.1 乙烯诱导气孔关闭由图1可以看出，在一定浓度范围内，乙烯利可诱导拟南芥气孔关闭，且具有浓度效应。洗脱实验显示，当乙烯利浓度在0.004%时保卫细胞保持良好的活性，据此在以下的实验中以此浓度作为最佳处理浓度。2.1.2 H2O2清除剂和合成抑制剂对乙烯诱导气孔关闭的影响图2 H2O2清除剂和合成抑制剂对乙烯诱导拟南芥叶片气孔关闭的影响Fig.2 Effects of H2O2 synthesis inhibitors and H2O2 scavenger on ethylene-induced stomatal Arabidopsis thaliana L.注：AsA：0.1mmol/L SHAM ：0.01mmol/L DPI： 0.01mmol/L closure in ArabidopsisDPI为NADPH氧化酶抑制剂，SHAM是细胞壁过氧化物酶抑制剂，由图2得知，单独用H2O2的清除剂和合成抑制剂处理对拟南芥叶片气孔开度无明显影响；然而当和0.004%乙烯利共处理时，可抑制乙烯诱导的气孔关闭。由此说明NADPH氧化酶和细胞壁过氧化物酶途径产生的H2O2参与乙烯诱导的气孔关闭过程。2.2 H2S参与乙烯诱导气孔关闭过程图3 H2S合成抑制剂对乙烯利诱导拟南芥气孔关闭的影响Fig.3 Effects of H2S synthesis inhibitors on ethylene-induced stomatal closure in Arabidopsis thaliana L.注：A: CK B: 0.4 mmol/L AOA C: 0.4 mmol/L NH2OH D: 0.2 mmol/L C3H3KO3+0.2 mmol/L NH3从图3得出，一定浓度的H2S的主要合成酶L/D-半胱氨酸脱巯基酶抑制剂AOA、NH2OH，L/D-半胱氨酸脱巯基酶产物C3H3KO3+NH3单独处理对拟南芥叶片气孔开度无明显影响，但是和0.004%乙烯利共处理时，均可不同程度的减弱乙烯利诱导气孔关闭的作用（P0.05）。由此推测，L/D-半胱氨酸脱巯基酶途径产生的H2S参与乙烯利诱导的拟南芥气孔关闭。2.3 H2O2与H2S在乙烯诱导气孔关闭过程中的相互关系2.3.1 H2O2位于H2S上游参与乙烯诱导气孔关闭的可能性2.3.1.1 H2O2清除剂及合成酶抑制剂对乙烯调控的拟南芥叶片H2S含量的影响H2S和H2O2均参与乙烯诱导气孔关闭过程，为探明二者在信号链中的上下游关系，检测了H2O2的清除剂和合成酶抑制剂对拟南芥中乙烯调控的H2S含量和L/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的影响。H2O2的清除剂和合成酶抑制剂均可不同程度的抑制乙烯利诱导的拟南芥叶片H2S含量升高（图4）及L/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的增强（图5）；其中细胞壁过氧化物酶的抑制剂SHAM和NADPH氧化酶的抑制剂DPI比PAO的抑制剂-HEH，DADD对乙烯利诱导的H2S合成及L/D-半胱氨酸脱巯基酶活性抑制明显（图4和图5）。由此推测，在乙烯调控气孔运动过程中，H2O2位于H2S上游，调控H2S的形成，进一步诱导拟南芥气孔关闭。图4 H2O2清除剂及合成酶抑制剂对乙烯调控的拟南芥叶片H2S含量的影响Fig.4 Effects of H2O2 scavenger and H2O2 synthesis inhibitors on ethephon-induced H2S concentrations in Arabidopsis leaves注：A: CK B: 1 mmol/L -HEH C: 0.5 mmol/L DADD D: 0.1mmol/L AsA E: 0.01mmol/L SHAM F: 0.01mmol/L DPI2.3.1.2 H2O2清除剂及合成酶抑制剂对乙烯调控的拟南芥叶片H2S合成酶活性的影响（a）（b）图5 H2O2清除剂及合成酶抑制剂对乙烯调控的拟南芥叶片L-半胱氨酸脱巯基酶活性（a）和D-半胱氨酸脱巯基酶活性（b）的影响Fig.5 Effects of H2O2 scavenger and H2O2 synthesis inhibitors on L/D-cysteine desulfhydrase in Arabidopsis leaves注：A: CK B: 1 mmol/L -HEH C: 0.5 mmol/L DADD D: 0.1mmol/L AsA E: 0.01mmol/L SHAM F: 0.01mmol/L DPI2.3.1.3乙烯对拟南芥H2O2合成突变体叶片H2S含量的影响为了更好的证明H2O2位于H2S上游参与乙烯诱导气孔关闭的可能性，检测了0.004%乙烯对拟南芥H2O2合成突变体叶片中H2S含量。从图6和图7得知，0.004 %乙烯利可诱导拟南芥野生型和H2O2合成突变体H2S含量及L-/D-半胱氨酸脱巯基酶活性升高，但对H2O2合成突变体诱导程度都不如野生型明显。相对NADPH氧化酶途径的突变体AtrbohF和AtrbohD，0.004%乙烯对PAO途径突变体Atpao2和Atpao4的诱导作用较为显著。由此进一步说明NADPH氧化酶和PAO途径产生的H2O2参与乙烯诱导的H2S的合成。图6 0.004%乙烯对拟南芥野生型和H2O2突变体叶片H2S含量的影响Fig.6 Effects of H2S concentrations induced by 0.004% ethephon in Arabidopsis and H2O2 mutant leavesWT Atpao2 Atpao4 AtrbohF AtrbohD 2.3.1.4乙烯对拟南芥H2O2合成突变体叶片H2S合成酶活性的影响（a）（b）图7 0.004%乙烯对拟南芥野生型和H2O2合成突变体叶片L-半胱氨酸脱巯基酶活性（a）和D-半胱氨酸脱巯基酶活性（b）的影响Fig.7 Effects of L/D-cysteine desulfhydrase induced by 0.004% ethephon in Arabidopsis and H2O2 mutant leaves2.3.2 H2O2位于H2S下游参与乙烯诱导气孔关闭的可能性2.3.2.1 H2S清除剂及合成酶抑制剂对乙烯调控的拟南芥保卫细胞H2O2含量的影响为进一步了解在乙烯诱导拟南芥气孔关闭过程中H2O2和H2S的相互关系，我们研究了H2S清除剂HT，合成酶半胱氨酸脱巯基酶抑制剂AOA和NH2OH以及C3H3KO3+NH3对乙烯诱导保卫细胞中的H2O2产生的影响。由图8得知，HT、AOA、NH2OH以及C3H3KO3+NH3都不能明显抑制乙烯诱导的保卫细胞中H2O2水平的增加。说明H2S不是在H2O2的上游参与乙烯对气孔运动的调控。图8 H2S清除剂及合成酶抑制剂对乙烯调控的拟南芥保卫细胞H2O2含量的影响Fig.8 Effects of H2S scavenger and H2S synthesis inhibitors on ethephon-induced H2O2 concentrations in Arabidopsis thaliana guard cells注：A: CK B:15mol/LHT C: 0.4 mmol/L AOA D: 0.4 mmol/L NH2OH E: 0.2 mmol/L C3H3KO3+0.2 mmol/L NH32.3.2.2乙烯对拟南芥野生型及H2S突变体保卫细胞H2O2含量的影响图9 0.004%乙烯对拟南芥野生型和H2S突变体保卫细胞H2O2含量的影响Fig.9 Effects of H2O2 concentrations induced by 0.004% ethephon in Arabidopsis and H2S mutant thaliana guard cells利用H2O2特异性荧光探针H2DCF-DA，检测0.004 %的乙烯利对拟南芥野生型及由图9可以看出，拟南芥野生型及H2S合成突变体Atlcdes和Atd-cdes气孔保卫细胞均含有一定水平的内源H2O2，0.004 %乙烯利能够明显增加野生型和Atlcdes和Atd-cdes突变体气孔保卫细胞的H2O2水平。由此进一步推测，在乙烯诱导气孔关闭过程中H2S位于H2O2的下游。3 讨论 气孔运动的调控机制是一个复杂的过程，业已证明，乙烯在调控气孔运动中发挥着重要作用，例如，1983年Madhavan、2006年Desikan等以及2009年刘国华等分别用不同的材料证明乙烯可以诱导植物的气孔关闭。本实验进一步证明了乙烯能够促进气孔关闭。H2O2是细胞正常代谢活动的产物，植物细胞可以通过多条途径产生H2O2，除了电子传递过程中产生的H2O2外，H2O2还可以由质膜上的 NADPH 氧化酶，细胞壁中的多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）和细胞壁过氧化物酶等途径合成。随着研究的不断加深，H2O2 在植物体内可以作为信号分子发挥作用，例2004年Desikan 等人实验结果表明ABA处理能够引起H2O2的迅速积累，从而导致气孔关闭。2009年刘国华等实验证明来自NADPH氧化酶及细胞壁过氧化物酶的H2O2参与了乙烯诱导拟南芥气孔关闭的过程。本实验以拟南芥为材料发现，单独用H2O2的清除剂或者抑制剂处理时对气孔开度无明显影响；然而当与0.004%乙烯利共处理时，可阻遏乙烯利诱导的气孔关闭（图2）。由此推测，来自NADPH氧化酶和细胞壁过氧化物酶途径产生的H2O2参与乙烯诱导的气孔关闭过程。近年来越来越多的证据显示，H2S在植物体内也发挥着重要的作用，并且与气孔运动的调控有关（Garca-Mata和Lamattina等，2010）。在本实验结果显示，一定浓度的H2S的主要合成酶L/D-半胱氨酸脱巯基酶抑制剂单独处理对气孔开度无明显影响，但和0.004%乙烯利共处理时，均可不同程度的减弱乙烯利诱导气孔关闭（图3），由此推测，来自L/D-半胱氨酸脱巯基酶途径产生的H2S参与乙烯利诱导的拟南芥气孔关闭。作为两种重要的气体信号分子，H2O2和H2S都参与了乙烯诱导的拟南芥气孔关闭。那么两者在乙烯调控气孔运动信号链中的关系怎样？结果发现，H2O2的清除剂和合成酶抑制剂均可不同程度的抑制乙烯利诱导的拟南芥叶片H2S含量的升高及L/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的增强；H2O2合成突变体在乙烯诱导的情况下，叶片中H2S含量及L/D-半胱氨酸脱巯基酶活性的增长幅度明显的低于野生型拟南芥，由此进一步说明NADPH氧化酶及细胞壁过氧化物酶产生的H2O2参与乙烯诱导的H2S的合成。在使用激光共聚焦显微技术检测时发现，H2S清除剂HT、合成酶半胱氨酸脱巯基酶抑制剂AOA和NH2OH以及C3H3KO3+NH3对乙烯诱导保卫进行处理后，均不能明显抑制乙烯诱导的保卫细胞中H2O2水平的增加，在乙烯诱导的情况下，拟南芥野生型及H2S合成突变体植株保卫细胞均有一定水平的内源H2O2。综合以上实验结果，本论文提出在拟南芥保卫细胞内存在一条尚未报道过的信号转导途径：乙烯H2O2H2S气孔关闭。致谢本篇论文是在我的指导老师XXX教授悉心指导下完成的，无论是从前期的论文的前论文立题背景、实验设计以及实验中期具体实验的技术指导，还是最后阶段论文攥写和修改，XXX教授都倾入大量的心血。XXX教授以她那广博的知识、严谨的治学态度，宽厚豁达、乐于助人的处事方式以及对科学研究的热爱深深的影响着我，并成为我以后学习的榜样，在实验室这段时间内无论是在工作、学习还是在生活上，XXXX教授也给予了我很大的帮助。在此，我谨向XXX教授致以崇高的敬意和衷心的感谢。在整个实验过程中我得到了XXXX情无私的帮助，特别感谢本实验室的XXXXXXX等在实验过程及论文攥写和修改过程中给予我的帮助，也特别感谢XXXXXXX等同学在实验过程对我实验的帮助，在此表示衷心的感谢，祝愿他们学习和工作顺利！最后感谢XXXXX有师哥师姐以及实验室所有的同学，感谢他们在生活上对我提供的无微的照顾，向他们表示我衷心的感谢和诚挚的祝福！参考文献1 刘国华，侯丽霞，刘菁等. NO与H2O2参与乙烯诱导的拟南芥叶片气孔关闭. 自然科学进展，2009，19(7): 8-18.2 刘菁，侯智慧，赵方贵等. H2S参与ABA诱导的蚕豆气孔关闭. 西北植物学报，2011，31(2): 298-304.3 侯智慧，刘菁，候丽霞等. H2S可能作为H2O2的下游信号介导茉莉酸诱导的蚕豆气孔关闭J. 植物学报，2011. 4 张立军，宋广周，白霜等. H2O2对不同大豆品种低温萌发及主要抗氧化酶活性的影响. 大豆科学，2008(01): 97-100.5 Abe K, Kimura H. The possible role of hydrogen sulphide as endogenous neuromdulatorJ. Neurosei，1996,16: 1066-1071.6 Abe K, Kimura H. The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulatorJ. Neurosci, 1996, 16: 1066-1071.7 Clough SJ, Bent AF. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana J. Plant J,1998, 16(6): 735-743.8 Desikan R,Cheung MK, Bright, et al. ABA, hydrogen peroxide and nitric oxide signalling in stomatal guard cells J. J Exp Bot, 2004,55(395): 205-212. 9 Eto K, Asada T, Arima K, Makifuchi T et al. Brain hydrogen sulfide is severely decreased in Alzheimers disease J. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 293: 1485-1488.10 Fan B, Shen L, Liu K, et al. Interaction between nitric oxide and hydrogen peroxide in postharvest tomato resistance response to Rhizopus nigricans J. J Sci Food Agric, 2008, 88(7): 1238-1244.11 Fotopoulos V, De TM, Barnes J, et al. Altered stomatal dynamics in ascorbate oxidase over-expressing tobacco plants suggest a role for dehydroascorbate signalling J. Exp Bot, 2008, 59(4): 729-737.12 Garca-Mata C, Lamattina L. Hydrogen sulphide, a novel gasotransmitter involved in guard cell signalling J. New Phytol, 2010, 188(4): 977-984.13 Geng B, Chang L, Pan QY et al. Endogenous hydrogen sulphide regulation of myocardial injury induced by isoproterenol J. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 318(3): 756-763.14 Kimur