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高低。根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行的酶活性浓度测定，原理科学、方法简便、灵敏度高、成本低、应用广泛。 (一)酶活性浓度的表示方法酶活性用活性单位表示，常用的酶活性单位有惯用单位、国际单位和Katal单位。 1惯用单位 20世纪50年代以前常用首先报告某种酶测定方法的临床酶学家的名字来命名该酶的活性单位，如测定AMY的Somogyi单位，转氨酶的Karmen单位等。酶不同，惯用单位就不同，即使同一种酶也因测定方法不同而有数种活性单位，应用不便，现已少用。 2国际单位 1963年国际酶学委员会推荐采用国际单位来统一表示酶活性的大小，即在25及其他最适条件下，每分钟催化1微摩尔底物转化成产物所需要的酶量为一个国际单位。1965年将温度改为30，1972年又取消了对温度的规定。到1976年对酶活性单位的定义为：在特定的条件下，1分钟内转变1微摩尔底物的酶量为一个国际单位，以IU表示，即1IU=1molmin。由于未指定反应温度，目前省略国际二字，即常将IU简写为U。 3Katal单位 1979年国际生化协会为了使酶活性单位与国际单位制(SI)的反应速率相一致，推荐用Katal单位(也称催量，简写为Kat)。即在规定条件下，每秒钟催化1摩尔底物转化所需的酶量，1 katal=1 mols。我国法定计量单位制中的酶催化活性单位为katal，其对血清中酶量而言显然过大，故常用单位为katal或nkatal。1 katal=60106U，1 U=1molmin=16.67nmols=16.67nkatal。 4酶活性浓度单位 临床上测定的不是酶的绝对量而是浓度。酶活性浓度以单位体积所含的酶活性单位数表示。常用UL来表示体液中酶催化浓度，也可用katal/L报告酶活性浓度。 (二)酶促反应进程 酶促反应体系中，底物浓度S和产物浓度P随着反应的进行不断发生变化。如将酶反应过程中测得的P或S变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线(图4-1)。该曲线反映了酶促反应进程中主要成分的变化规律，也可以从中得到酶促反应的速度。图中P或S变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。典型的酶促反应过程一般包括三个时期，即延滞期、线性期和非线性期。 1延滞期 延滞期(lag phase)是指反应开始的一段时间，此时S开始下降，随之有相应P逐渐增加。但由于多种因素的影响，该期酶促反应速度比较慢。不同反应的延滞期长短不等，可以从几秒到几分钟。单一酶促反应的延滞期是从反应开始至达到最大反应速度所需要的时间。期间发生的变化包括酶活性中心的形成与催化位点的暴露、酶与辅酶因子的结合、底物的解离、底物与酶的结合等。酶偶联反应的延滞期较长，除了以上过程之外，还包括中间产物的积聚、指示反应速度增加、指示反应速度与待测酶的酶促反应速度达到平衡所需的时间。因此，辅助酶越多延滞期就越长，通常为13分钟。2线性期 线性期(linear phase)是指延滞期后酶促反应速度达到最大反应速度并保持相对恒定的一段时期，此时有过量底物存在，时间进程曲线呈直线或接近直线状态。 因线性期底物量足够，酶促反应速率不受底物浓度的影响，产物P和底物S变化与t成直线关系，因此测定此时的酶促反应速率就能较好地反映酶活性的大小。不过线性期是一个相对的概念，试剂中底物用量不可能大到完全不限制酶活性发挥的程度，而且底物量随着反应进行而不断消耗。一般认为，当底物消耗量小于5，不足以明显改变反应速度时，仍认为酶促反应以初速度即最大速度进行。在选定条件下，标本中酶浓度越高，其线性期就越短。在实际工作中往往需要根据酶促反应动力学曲线，来设定线性期和非线性期的界限。 3非线性期 非线性期(non-inear phase)又称底物耗尽期，是指线性期后反应速率明显下降、酶促反应进程曲线偏离直线的一段时期。随着反应的进行，底物浓度不断下降，产物浓度不断上升，使反应体系中逆反应增加；反应产物的抑制作用、酶的热失活、酶的聚合或解离等也会增加，这些原因会使酶促反应变慢。在这段时期酶促反应速度受底物浓度的影响较大，产物P和底物S变化与时间t之间不成直线关系。可见，只有依据酶促反应进程曲线中线性期的反应速率才能准确计算出反应体系中的酶活性浓度。因此，不论采用哪种酶活性浓度测定方法，都应该尽量保证在线性期进行检测，如果在延滞期或非线性反应期检测势必造成较大的误差。二、酶活性测定方法按照检测时段的不同，酶活性测定方法可分为定时法和连续监测法两大类。 (一)定时法定时法(flxed time assay)指测定酶促反应过程中某一段时间内底物的消耗量或产物的生成量，计算出该时段内的平均反应速度，再换算成molmin，以此代表待测酶的活性浓度。该法一般是在反应一开始即计时，到达设定时间时加入终止剂(强酸、强碱、蛋白沉淀剂等)终止酶促反应，测定这段时间内底物或产物浓度的变化，因此，不仅底物或产物浓度的测定要准确，还必须计时准确。1定时法的特点 主要优点是设备简单，操作方便，检测过程中不需要恒温设备，用分光光度计即可测定；也不用考虑显色剂对酶活性的影响，是早期测定酶活性浓度的常用方法。 定时法的主要不足在于不能确保选定的测定时段全部处于线性期，因此测定误差难以估计。如图4-2所示，用定时法测定3个标本的某酶活性时，他们的反应进程不同，所含的酶活性浓度不等。但如果取t1到t2这一相同时间段来测定，由于产物的变化量相同，计算出的反应速度也就相等。造成这种错误的原因在于，此检测时段曲线1的酶促反应已经减慢进入非线性期，检测时间包含有线性期和部分非线性期，曲线2的酶促反应还没有达到最大反应速度，检测时间包含了部分延滞期，两者测定结果都不能代表体系中的酶活性，只有曲线3完全处于线性期，产物变化量与酶浓度成正比，测定的结果才准确。因此，用定时法时必须先了解反应体系的时间进程曲线特征，找出反应速度恒定的时期为测定时段。在实际工作中，延滞期很难确定，而且一般很短，对酶活性测定产生的影响不大。但非线性期的影响不容忽视，随着保温时间的延续，酶变性失活加速，逆反应加强，对活性测定产生的影响非常明显。 2定时法酶活性的计算 根据测定方法的不同，可以利用标准比较法、标准曲线法或吸光系数法计算出酶活性浓度单位。过去常用的是前两种方法，即同时测定标准品和样本，根据吸光度变化来计算样本酶活性，但有很大不足。主要是因为没有真正的酶标准品，大多是用酶反应产物(或底物)的标准品来代替。这样做不包含真正的酶促反应，即使将该标准品在基本上相同于样本的条件下进行化学反应，测定误差不可避免，因此现已少用。 目前常用的是吸光系数法，根据待测底物或产物的摩尔吸光系数和测定方法计算出酶活性浓度单位。例如某样本中的酶活性为x UL，取样量Vs(ml)与底物缓冲液Vr(ml)孵育，经过t分钟反应，加入终止液Ve(ml)，检测到产物吸光度增加为A，该产物的摩尔消光系数为，比色皿光径为b cm。 根据朗伯-比尔定律A=bc可得，c=Ab。 其中c为产物的浓度，即产物的总变化量dP，根据以上公式可求出反应速度即酶活性为：乘以测定时的稀释倍数，再换算成国际单位，即可得样本中的酶活性X(UL)： 式中反应总体积Vt=Vs+Vr+Ve。 (二)连续监测法 连续监测法(continuous monitoring assay)是连续监测酶促反应进程中某一反应产物或底物浓度随时间变化的多点数据，找出反应的线性期，求出最大酶促反应速度，从而计算酶活性浓度。具体方法是将待测酶与合适底物在特定条件下孵育，在酶促反应的线性期每隔一定时间连续多次检测酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率，再求出酶活性浓度。因此，连续监测法有时也称为速率法。 1连续监测法的特点 与定时法不同，连续监测法不需要终止酶促反应，不需添加其他显色试剂，直接检测待测酶反应或偶联的指示酶反应的产物或底物变化，很容易观察反立的整个过程。连续监测法的优点是连续观测反应进程，可以明确找到反应的线性期，。 连续监测法在特定条件下进行，要求足够的底物浓度，还要精确控制温度、pH值等反应条件，对仪器要求较高，需要具有恒温装置和连续记录吸光度装置。半自动或全自动生化分析仪都能达到这些要求。随着自动生化分析仪的普及，连续监测法已逐步取代定时法，成为目前最常用的方法自动生化分析仪能自动间隔一定时间(1060秒)测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，以测定结果对时间作图，绘制反应进程速度曲线，自动判断是否偏离线性，因而可以选择线性期来测初速度从而计算酶活性，所以连续监测法更适合于自动化仪器，其结果远比定时法所测平均速度准确，在高浓度标本时尤为明显。由于一般的光度计所测得的摩尔吸光系数与理论值差别较大，在实际工作中最好带标准品一起测定。连续监测法还可以根据理论的摩尔吸光系数计算出理论K值。在发表的各种酶活性测定方法中，几乎每个酶都有定时法和连续监测法可供选择，从测定准确度出发，应优先选择连续监测法。 2连续监测法酶活性的计算 用连续监测法进行酶活性测定时，根据摩尔吸光系数可以进行酶活性浓度的计算。检测到线性期内的每分钟吸光度变化即Amin，其酶活性计算公式即为 上式中 建立了某种酶的测定方法后，其中、Vt和Vs均为定值，不同分析仪中b不同，但自动生化分析仪一般都自动将其换算为1cm，因此K值为一个定值，可通过计算得出，称为理论K值或计算因子，设定到自动生化分析仪中。 3连续监测法的方法类型 根据检测物质是不是待测酶的底物或产物，可将连续监测法分为直接法和间接法。 (1)直接连续监测法：是直接测定反应体系中待测酶的某一底物或产物的理化特性(吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率等)的变化，计算出酶活性浓度。该法虽然简单，但适用范围小，只有当底物与产物某一理想化性质有显著差异且便于检测时，才能使用。故至今只有很少一部分酶能用直接法进行测定。 (2)间接连续监测法：是连续监测法中常用的类型，又分为一步间接法和酶偶联法。一步间接法指在原来反应体系中加入一些试剂，这些试剂不与酶作用也不影响酶的活性，但能与产物迅速作用，产生可以被检测的物质。酶偶联法指在原来的反应体系中再加入一些酶试剂，使加入的酶促反应和被测酶的酶促反应偶联起来，最后的反应产物可直接监测，进而推测出第一个酶的活性浓度。在酶偶联体系中，被测定的酶(Ex)催化的反应称为始发反应，产生被检测物质的反应称为指示反应，参与偶联反应和辅助反应的酶统称工具酶，其中催化指示反应的偶联酶也称指示酶(Ei)。根据连续监测法偶联体系和检测信号的不同，可以设计多种检测方法。常用的间接连续监测法主要有四大类：以人工合成色素原底物反应为基础的色素原底物连续监测法、以NAD(P)H和NAD(P)+吸光度变化为基础的脱氢酶反应连续监测法、以Trinder反应做指示反应的氧化酶连续监测法和特殊反应类型的连续监测法，详见本章第三节代谢物的酶法分析。 三、酶活性测定的条件优化 酶的催化活性与酶促反应的最大速度成正比，只有当反应速度为最大反应速度时V才与酶量E成正比。也只有在此基础上建立起来的测定方法才可靠和准确。因此，测定酶活性浓度的推荐或参考方法都提出酶活性浓度测定的条件应是酶促反应的最适条件。 所谓最适条件(optimum condition)是指能满足酶促反应速度达到最大反应速度所需的条件，包括：合适的底物和足够的底物浓度；理想的缓冲液种类和最适离子强度；反应液的最适pH；最适反应温度；合适的辅因子、激活剂浓度；酶偶联反应中最适的指示酶和辅助酶用量；合理的测定时间，包括延滞期尽量短暂，有足够的线性期；合适的样本与试剂比例；足够的检测范围；尽量去除各种抑制剂等。 (一)底物种类和浓度 1底物种类的选择 底物是酶促反应体系中最重要的因素之一，底物选择的原则是：尽量选择Km最小的底物，最好是酶的天然底物；要有足够的溶解度；酶对底物特异性高；底物稳定性好；有较高的临床价值。 (1)要考虑待测酶的特异性：不同酶对底物的专一性有很大的差别，例如，丙氨酸氨基转移酶对底物有立体异构选择性，只能催化L-丙氨酸发生氨基转移反应。若选择DL-丙氨酸，要达到同样的反应速度，则需2倍于L-丙氨酸的用量。对于这些特异性很高的酶而言，选择底物的种类比较简单。但对于一些特异性较差的酶来说，底物种类的选择必须要有理论依据。 (2)要考虑底物的稳定性和临床价值：例如用于淀粉酶测定的人工合成底物很多，但都存在一个共同的缺点，即底物本身可以自发水解。该酶测定的参考方法要求用亚乙基封闭的对硝基酚麦芽庚糖苷做底物(EPS法)，就是因为该底物的稳定性好。又如临床上测定酸性磷酸酶主要目的是诊断前列腺癌，所选的底物应对前列腺酸性磷酸酶有较高的特异性，以麝香草酚磷酸盐做底物最合适。 2底物浓度的确定 酶的米氏常数(Km值)是酶促反应速度达到最大反应速度Vmax一半时的底物浓度，用molL表示，大多数酶Km在1 O-31 O-5molL之间。Km值是选择底物浓度的关键参数之一，代表了酶对底物的亲和力，Km越小表示酶与底物的亲和力越大，反之亦然。 (1)单底物酶促反应：根据Michaclis-Menten方程很容易得出以下结论：若S=10Km，则反应速度达到最大反应速度的909；若S=20Km，则反应速度达到最大反应速度的952；只有当S无穷大时，反应速度才达到最大反应速度，这在实际工作中是不可能的。因此，底物浓度的确定原则是选择S=1O20Km，此时反应速度基本达到最大反应速度，测定的误差可以接受。 (2)双底物酶促反应：双底物酶促反应动力学与单底物相比更复杂，底物浓度的确定要以动力学方程为基础，用乒乓机制、序列有序机制和随机机制等进行分析。双底物酶促反应速度达到最大反应速度的程度一般要求为9095，根据不同机制的动力学方程，可以求出两底物的用量。 (二)缓冲液 缓冲液对酶活性的影响包括缓冲液的种类、离子强度和最适pH等方面。 1缓冲液种类 酶促反应体系中，缓冲液的选择十分重要。在酶与底物的结合中，酶和底物都需要合适的解离状态；酶催化基团作用的发挥也需要酶、辅助因子的有效解离；酶的稳定性也需要合适的环境。这一切都离不开缓冲液的作用。依据对酶活性的影响可将缓冲液分为活性缓冲液、惰性缓冲液和抑制缓冲液。 2最适pH 在最终反应体系中，酶促反应速度达到最大时的pH称为最适pH。一般来说，血清中大多数酶的最适pH接近中性。有些酶在最适pH附近活性变化非常显著，但多数酶在一定pH范围内相对稳定。测定酶活性时一定要选择在最适pH处。最适pH并非酶的特征性常数，易受多种因素如缓冲液种类、底物浓度、反应温度、样本与反应试剂的比例、防腐剂和添加剂等影响而改变。 3离子强度 缓冲液的离子强度也会影响酶的活性，一般选择与体液比较接近的离子强度。离子强度越高，电解质会干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，但离子强度过低也会抑制酶活性。 理想的缓冲液应有足够的缓冲容量，较强的缓冲能力和较高的纯度。选择缓冲液时尽量选择活性缓冲液或惰性缓冲液，不可选择抑制型缓冲液，对酶活性表达有促进作用和稳定作用则更好。目前常用的缓冲液有N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、N，N-双(2-乙磺酸)哌嗪(PIPES)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三乙醇胺(TRA)、二乙醇胺(DEA)、2-甲基-2-氨基-1-丙醇(AMP)等。 (三)反应温度 温度越高，反应活化能越大，酶与底物结合的机会越多，反应速度越快。但是，温度增高，酶的变性失活就会增加。由于结构和性质的差异，不同酶的最适温度可以不同。从实际工作方便来考虑，常规实验室越来越多的使用37。因为温度越高，反应速度越快，灵敏度越高，延滞时间和测定时间都可能缩短，有利于提高工作效率。全自动生化分析仪，有高效率的恒温系统，使反应系统很快升温并维持在37，可避免温度差异引起的误差。在比较不同实验室测定结果时，要注意温度不同带来的差异。 (四)辅酶、辅基和激活剂 结合酶是由酶蛋白和辅助因子组成的。根据酶催化反应最适条件的要求，原则上在酶测定体系中应加入一定量的辅酶、辅基和金属离子激活剂等辅助因子。脱辅基酶蛋白与辅基孵育一段时间后，酶活性才会恢复，因此，往往需要样本与试剂中的辅基先预孵育。辅酶尽管不同于酶的底物，但在作用方式上和底物类似，在酶促反应过程中与酶结合、分离及反复循环。辅酶用量的确定按底物处理。激活剂的化学本质是金属离子，可以是酶的活性中心，也可以通过其他机制激活酶的活性。金属离子之间往往存在相互拮抗或相互抑制，选用时要特别注意。 (五)抑制剂 酶活性测定过程中的抑制剂种类很多，有产物、底物、分析器材或试剂中的重金属及体液中的药物等。抑制类型可以是可逆性抑制，也可以是不可逆性抑制。按最适条件的要求，不管哪种抑制剂，都要尽量去除。采取的措施包括：选用高纯度的实验原料和实验用水，在反应液中加入金属螯合剂，必要时可以引入一个副反应来去除产物的抑制作用等。 (六)酶偶联法中的辅助酶和指示酶 1指示酶和辅助酶的种类指示酶和辅助酶选择的依据是：特异性要高，尤其是指示酶，应尽量减少副反应的发生，提高检测准确度，如果存在副反应，则使测定酶的结果偏高；辅助酶的数量尽量少，减少辅助酶就可以缩短延滞期；酶偶联反应要合理，如能直接与指示酶偶联，就没有必要加入辅助酶；尽量选用Km小的指示酶或辅助酶，以缩短延滞期；最适条件尽量与测定酶接近；其他因素，包括稳定性、纯度、价格和来源等。2指示酶与辅助酶的浓度确定 辅助酶或指示酶用量不足的后果是延滞期增长，待测酶的可测范围变窄，严重时不出现线性期。辅助酶或指示酶用量过大，成本增加，杂酶的干扰程度增加。所以在酶偶联测定法中，选用适当量的工具酶是一个重要的问题。可用不同量的工具酶反复试验，直到偶联酶反应中指示酶反应速度不随工具酶的增加而升高，延滞期合适，有足够的线性期，待测酶上限符合临床要求，酶浓度曲线的线性关系好等。 四、影响酶活性测定的方法因素除了酶促反应体系和反应条件以外，方法因素与检测系统对酶活性浓度的测定也有重要影响。 (一)基本方法因素 1方法类型的选择 尽量选用连续监测法。因为该方法选择线性期的反应速度来计算酶活性，测定结果更可靠，一般不需做样本空白，干扰相对较小，是首选的方法。但连续监测法对仪器要求相对较高，在不具备自动生化分析仪的基层单位，某些酶采用定时法测定也可以得到比较准确的结果。如ALP的测定，按照IFCC推荐的方法，以4-硝基磷酸酚钠盐(PNPP-Na2)为底物，以2一甲基一2一氨基一1一丙醇(AMP)做缓冲液，该反应的延滞期短，小于1分钟；线性期长，400U的样本，线性期可达1 5分钟；产物对硝基酚有标准品供应；终止液NaOH对产物的摩尔消光系数没有影响，因此，采用定时法能得到与连续监测法相近的准确性。 2正向反应与逆向反应 酶促反应大多是可逆反应，一般根据测定底物或产物的难易程度来选择正向反应还是逆向反应。原则上选择对底物亲和力大，酶转换率高的方向；还应考虑内源性干扰、底物价格和稳定性等诸多因素。肌酸激酶(CK)催化的逆向反应速度是正向反应速度的6倍，而且不受ATP酶、ALP、内源性丙酮酸等干扰，所以，目前普遍采用逆向反应。但是，乳酸脱氢酶(LDH)的测定是选择正向或逆向反应，目前尚有争议。国内多采用正向反应(乳酸丙酮酸，LP方向)，与IFCC在2001年发表的操作手册一致。理由是LDH常被组合在心肌酶谱中，正向反应有利于LDH1的活性测定，有更高的诊断敏感性，试剂稳定性好。而以前国外常用方法却是逆向反应(丙酮酸乳酸，PL方向)，理由是反应速度是正向的3倍，而且试剂成本低。 3检测底物或检测产物 选择测定底物或产物的方法主要取决于哪个更方便。原则上应选择测定产物的生成量而不是底物的消耗量。为了让全部的酶能够与底物结合，底物量往往很高，而且酶促反应测定的是初速度，时间较短。若测定底物的消耗量(起始底物浓度剩余底物浓度)，一方面要求起始底物浓度不能太高，另外在很短的时间内，底物的消耗并不明显，测定误差大。而测定产物是因为产物从无到多，检测敏感度必然增加。这也是淀粉酶的碘淀粉比色法逐渐被色素原底物所取代的原因之一。目前在众多酶活性测定中，除了把测定NADH减少可以看成是测底物的消耗量外，采用测定底物消耗量的项目己很少。 若有两个以上产物，选择测定哪个产物，也要从测定的方便性、内源性干扰等方面综合考虑。例如ALT催化的反应既可以测定谷氨酸的生成速度，也可以测定丙酮酸的生成速度，IFCC推荐法是测定后者。 4底物启动模式与样本启动模式底物启动模式是指样本先与部分试剂(缺乏某个底物)预孵育一定时间，然后加入这个底物，样本中的待测酶的酶促反应才开始启动。这样做的好处是在待测酶酶促反应开始之前，可以除去某些干扰物，包括内源性干扰物和外源性干扰物。IFCC推荐法多采用底物启动模式，但需要双试剂剂型。而样本启动模式是将反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样本，依靠样本中的待测酶来启动酶促反应。该模式只是在延滞期去除部分干扰物，但可采用单一试剂剂型。需要注意的是某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并没有将底物单独作为第二试剂，因此起不到消除内源性干扰的作用。 5副反应问题 NAD(P)H的光吸收特性是目前使用最多的指示反应。但是，体内存在数以百计的氧化还原酶，它们的辅酶很多是一致的。若存在内源性代谢物，必然会相互干扰。解决副反应的干扰，一直是人们努力的方向。通过加入副反应抑制剂、样本进行预处理等都是切实可行的手段。 6延滞期与线性期的确定 延滞期可因酶在样本中所存在的介质不同而有差别，原因可能是存在内源性干扰物，也可能存在一些抑制剂。延滞期的确定原则是多观察几例浓度不等、病理情况不同的标本，选择延滞期最长者作为确定值。线性期的确定离不开酶浓度的可测上限，因为酶浓度越高，在同样时间内消耗底物越多，产生产物越多，底物的不足和产物的抑制将导致非线性期的提前到来。 从以上分析中不难看出，基本方法因素也可影响酶活性测定的准确性，有些因素是通过影响酶促反应最适条件来起作用；各因素之间也有相互影响相互制约；而且没有绝对的最适条件，但只要按照最适条件的目标，在建立方法时，努力接近最适条件，最大限度地缩小方法之间、试剂之间的差别。 (二)检测系统对测定结果的影响 检测系统对测定结果的影响主要有以下几点： 1.仪器 不同的仪器，波长的设置有区别，带宽有区别，比色杯的透光性在使用过程中也会发生改变，这些都直接影响仪器对待测物的光吸光，也就影响K值的准确性。因此，要定期检查仪器的摩尔吸光系数，校正K值。 2校准品 可作为酶活性测定用的校准品分两类。一类是产物的基准物质，如对硝基酚、对硝基苯胺等，可用于校准仪器的摩尔吸光系数。产物NAD(P)H在所用仪器中的摩尔吸光系数可通过己糖激酶法测定葡萄糖来获得。另一类称酶校准品，多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比较接近，应尽量采用。 3实验参数 实验参数的正确理解和编制对测定结果也有很大影响。样本量、试剂量、延滞期、测定时间、K值等都是很关键的参数。对于采用色素原底物的方法，由于底物的自身水解作用，应采用减试剂空白变化速率的方法；对于辅助酶或指示酶中杂酶引起的干扰，也应采用减试剂空白变化速率的方法；对于内源性干扰的反应，不同的仪器应分别对待，不能盲目采用减空白的速率法，要选择是采用试剂空白还是样本空白。 4样本与试剂比例 样本量与反应液总量的比例与检测灵敏度和检测上限有关，与测定误差也有关。根据酶活性计算公式不难看出，改变样本与反应液总量的比例就可以改变K值。按仪器噪声相当于吸光度OOO1计算，K值不宜过大，否则会造成检测误差加大。值得注意的是酶活性的发挥与介质有关，经常发现改变样本与反应液总量的比例，测定结果并不会成正比例地改变，可能与激活剂、抑制剂、酶的解聚和聚合、酶的稳定性等因素有关。因此，样本与反应液总量的比例一旦选定，就不能随意更改。五、酶的质量测定 酶浓度严格来说是指酶分子的质量浓度，常用酶蛋白浓度来表示。人体体液中大多数酶的含量在gL水平，甚至更低，因此测定的难度较大。近年来，随着免疫学技术的发展，利用酶的抗原性，建立了一些直接测定酶蛋白质量的免疫化学方法。 (一)酶质量免疫化学测定法的原理 利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体，然后用免疫学方法测定酶蛋白质量浓度，单位多以ngm1、gL来表示。用于酶蛋白浓度测定的免疫化学法有免疫抑制法、免疫沉淀法、放射免疫法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、酶免疫法(EIA)、荧光酶免疫法(FEIA)等。其中，前两种方法也可用于酶活性浓度测定，例如用免疫抑制法测定CK-MB的活性，用免疫沉淀(单向扩散)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性等。 RIA是将放射性核素标记的酶分子与相应抗体作用产生沉淀，然后将沉淀分离并进行定量测定，如胰蛋白酶和弹性蛋白酶的质量测定就是用放射免疫法。此外，还可以用CLIA测定CK-MB的质量浓度，用酶联免疫分析(ELISA)测定神经元特异性烯醇化酶(NSE)的活性。 (二)酶质量免疫化学测定法的评价 与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：灵敏度高，能测定样本中用原有其他方法不易测出的少量或痕量酶；特异性高，几乎不受体液中其他物质，如酶抑制剂、激活剂等的影响；能用于一些不表现酶活性的酶蛋白，如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定；特别适用于同工酶的测定。 酶的免疫化学测定也有其局限性，主要表现在：要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的，且工作量较大；测定步骤多，操作烦琐；测定成本高。第三节代谢物的酶法分析 酶法分析(enzymatic method)是利用酶的作用特性，以酶作为分析工具或分析试剂的主要成分进行反应体系中底物、辅酶、抑制剂和激活剂等成分含量测定的方法。随着蛋白质纯化技术的发展和自动生化分析仪的普遍应用，许多临床生化检验项目都利用工具酶建立了酶学分析方法。 酶法分析具有以下的优点：酶作用的特异性高，成分复杂的血清或其他体液样本往往不需要预处理就能测定，使实验程序得以简化；试剂酶的本质大多是蛋白质，无毒性，避免了化学品对环境的污染；酶促反应的条件温和，商品化的试剂盒可用于自动化分析。因此，这一技术在临床生物化学检验中得到了广泛应用。一、酶法分析的理论基础 由于酶作用的特异性，成分复杂的血清或其他体液样本往往不需要进行预处理，通过温和适宜的酶促反应条件，简单的实验程序，即可对各种代谢物浓度进行定量分析。许多工具酶已应用于多种代谢物检测试剂盒的制备及临床标本的自动化分析之中。 (一)工具酶 工具酶(reagent enzymes)是酶学分析中作为试剂用于测定其他化合物浓度或酶活性浓度的酶。在利用工具酶的反应中，一般将工具酶及其辅助底物设定为过量，而将待测化合物或待测酶设定为限速因素。工具酶纯度要求不高，从而降低了其作为试剂的成本，但对抑制剂、杂酶等的含量要有一定的限制，以保证工具酶有一定的比活性，避免或减少一些干扰测定的因素。 许多临床生化检验项目，如葡萄糖、胆固醇、甘油、尿酸、丙酮酸等的测定均使用了工具酶。按照基本原理的不同，代谢物浓度的酶法测定通常分为平衡法和速率法两大类。 (二)平衡法的理论基础 平衡法，也叫终点法(end-point method)，指在代谢物酶促反应中，随着时间的延长，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，指示反应信号逐渐达到稳定，测定反应达到平衡后底物或产物变化的总量，计算出待测物浓度。由于该法的酶促反应并没有终止，而是达到了一个平衡状态，所以称平衡法更为合理。 根据酶促反应动力学原理，达到平衡所需的时间与Vmax、Km和待测物浓度S0有关，Vmax越大、Km越小、S0越小则达到平衡所需的时间就越短。 如同时检测标准管，则不管反应进行至何种程度，只要标准管与测定管的反应时间(t)一致，它们的底物消耗量或产物生成量都成比例变化，与产物的吸光度(As和Au)成正比。据此可以计算出待测物浓度。但只有当S0-St S0，即反应基本达到平衡时，Au和As基本稳定不变，此时的测定误差最小。若测定管与标准管的反应明显存在基质效应，两者反应程度不一，就会存在误差。 采用平衡法应该注意：工具酶的特异性要高；工具酶中的杂酶应低于允许限；酶的用量要足够大，以保证反应能在较短时间内(一般为13分钟)达到平衡；在保证测定线性的前提下，Km要尽量小；所用的底物对酶应构成零级反应；试剂中的添加剂不应抑制酶的活性。 (三)速率法的理论基础 速率法(rate assay)又称动力学法，是根据酶促反应动力学，准确测定反应的初速度(V)，采用标准浓度对照法求得待测物的浓度的方法。根据米氏方程 ，当SKm时，则S+KmKm；若体系中酶量不变，酶促反应的最大速度Vmax也不变，此时，酶促反应呈一级反应： 上式表明，当反应体系中酶量固定、底物浓度相对于酶的催化能力很小时，反应速度(单位时间内的底物减少或产物增加量)与初始底物浓度呈正相关，如同时检测测定管和标准管反应速度，即可计算出待测物浓度。 在酶促反应进程中，S越来越小，v也越来越小。说明要使酶促反应速度与待测物浓度成正比例，必须做到测定速度是初速度，越偏离初速度，测定误差就越大。实际上，准确地测定酶促反应的初速度非常困难，在临床酶法分析中只要在此期间待测物消耗Km，此时酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物浓度有关，表现为一级反应动力学。但在以NADH或NADPH为底物的终点法测定中，因340nm吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高.由于该类反应是通过辅酶在氧化型与还原型之间转换进行，所以很容易用分光光度法测定340nm处吸光度的增减来进行定量，如丙酮酸和乳酸的测定就是这样。 (二)酶偶联法 与酶活性浓度测定相似，酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的特性，需将反应生成的某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的，这种方法称酶偶联法(enzyme couNing method)。在酶偶联法中，一般把偶联的反应称为辅助反应(auxi_1iary reaction)，所用试剂酶叫辅助酶(auxi_1iary enzymes)，把指示终点的反应称为指示反应(indicator reaction)，指示反应所用的试剂酶叫指示酶(indicator enzyme)。 偶联反应需设计为非限速反应，即偶联反应中所用的酶、辅酶等底物用量应过量。在指示酶用量固定后，反应速度应与第一步反应速度有关，因此辅助反应应设定为一级反应。如果辅助反应为双底物，在实验设计时也应将试剂中加入的另一种底物浓度设计得足够大，让整个反应只受待测物浓度的影响。 在临床生物化学检验中，最常用的酶偶联指示系统有两个，即脱氢酶指示系统和过氧化物酶指示系统。 1.脱氢酶指示系统 该指示系统通过测定氧化型辅酶(NAD+或NADP+)在340nm处吸光度的增加来计算待测物的浓度。如己糖激酶法测定血清葡萄糖、尿素酶法测定血清尿素就是利用该指示系统。也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测定340nm处吸光度的下降来计算待测物的浓度。选择NAD+还是NADP+应根据试剂酶的特性来决定，有的酶要求NAD+，有的酶要求NADP+，有的酶则两者均可。2.过氧化物酶指示系统 该指示反应最早是由Trinder等人提出，其原理是代谢物在酶催化反应中如能够生成H202，则过氧化物酶(peroxidase，POD)就可催化H202与4-氨基安替比林(4-AAP)和酚一起形成红色的醌类化合物，该化合物最大吸收峰为500nm，该反应被称为Trinder反应(Trinder reactinn).除了酚之外，其他的生色基团也会发生类似的反应见表4-3。 POD指示系统已广泛用于葡萄糖、胆固醇、尿酸、肌酐、甘油三酯等多个生物化学项目的测定。 (三)酶循环法 酶循环法(enzymatic cycling assay)是利用底物和辅酶的循环反应，使酶促反应产物不断扩增以利于测定的方法。该法使反应产物增加，减少了共存物质的干扰，提高了检测灵敏度和特异性，是酶法分析的发展和延伸。 根据试剂酶的结合方式和辅酶的用法，将酶循环法分为底物循环法和辅酶循环法。根据试剂酶的催化性质又将其分成氧化酶脱氢酶反应法和脱氢酶辅酶反应法等。 1产物循环一氧化酶一脱氢酶系统 该系统中氧化酶用于靶物质的氧化，脱氢酶使其回到还原状态，促使靶物质(或其衍生物)或靶物质的氧化产物作为底物循环。例如甘油浓度测定时，甘油在甘油激酶催化下活化生成3一磷酸甘油后，被甘油磷酸氧化酶氧化为磷酸二羟丙酮，磷酸二羟丙酮又被3-磷酸甘油脱氢酶还原为3-磷酸甘油，这样就形成了一个循环，同时伴有NADH向NAD+的转化。在反复循环中3磷酸甘油和磷酸二羟丙酮的量不变，而产物H202随每次循环不断递增，NADH不断递减，使检测信号不断增强(图43)。 2脱氢酶一辅酶循环系统 该系统中靶物质(或衍生物)及其氧化产物作为底物进入循环，反应中用一种脱氢酶和两种不同性质的辅酶，即硫代氧化型辅酶I(Thio-NAD+)和还原型辅酶I(NADH)，在395415nm波长下测定反应中氧化型Thio-NAD+转为还原型Thio-NADH的速度。例如，血清胆汁酸测定时，3a-羟类固醇脱氢酶(3a-HSD)催化胆汁酸和3-酮类固醇之间的反应，正反应对辅酶硫代氧化型辅酶I的亲和力远远大于辅酶I，而逆反应对还原型辅酶I的亲和力大于硫代还原型辅酶I，在反应系统中有足够的硫代氧化型辅酶I和还原型辅酶I，只要有少量的胆汁酸就可生成少量的3一酮类固醇，并在两者之间构成循环，不断产生硫代还原型辅酶I(黄色)，按要求控制好条件，反应速度与待测物胆汁酸成正比(图4-4)。胆汁酸在体内的浓度只有微摩尔的水平，用此循环反应，灵敏度可增加数十倍。 该循环反应要求以下条件：酶对Thio-NAD+和NADH应有高度亲和力；Thio-NAD+和NADH二者的浓度配比达最适条件；溶液pH和缓冲体系同时有利于双向反应(底物氧化和还原)。脱氢酶一辅酶循环系统还可应用于肉毒碱、同型半胱氨酸、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇等的测定 (四)酶激活与抑制测定法 酶的催化活性可被某种物质激活，也可被一些物质抑制。利用这一特性可测定多种生化物质。 1酶激活测定法 通过特定的机制使酶由无活性变为有活性或使酶活性增强的物质称为酶的激活剂(activator enzyme)。许多酶只有在激活剂的存在下才具有催化活性。如果将酶中关键的激活剂去除，就会失去催化活性。测定时无活性的酶与标本混合后，标本中的金属离子、微量元素或辅酶使该酶重新激活，恢复催化活性的程度可以反映这些物质的含量。 例如，用EDTA和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)两种金属离子螯合剂在适宜浓度下抑制Ca2+，标本中Mg2+通过恢复异柠檬酸脱氢酶(ICD)的活性，使NADP+还原增多，在340nm下吸光度增加，据此测定Mg2+浓度。Zn2+能激活碱性磷酸酶(ALP)水解4-硝基酚磷酸生成4-硝基酚，通过检测405nm吸光度的上升速率，测定样本中Zn2+的含量。此外，色氨酸酶法和