细胞因子与病理过程20021213.ppt

细胞因子与病理过程 中国医科大学病理学教研室王恩华 细胞因子cytokines concept 是由细胞产生和分泌的低分子量的多肽类介质effect 参与调节细胞生长 分化 器官发育 炎症 免疫 肿瘤 损伤 修复等许多病理及生理过程来源 血管内皮细胞 WBC 中性 单核巨噬细胞 LC 纤维母细胞 神经组织 平滑肌细胞 软骨组织 肿瘤细胞等 1 白细胞介素类interleukinsILs2 集落刺激因子类colonystimulatingfactorsCSFs3 肿瘤坏死因子类tumornecrosisfactorsTNFs4 淋巴因子类lymphokines5 化学趋化因子类chemotacticfactors6 生长因子类growthfactors7 细胞粘附因子类celladhensionmolecules总之 几乎所有组成多细胞间复杂的生物信号语言中的各个元件 均属此范畴 Classification 细胞因子 autocrine 自泌 paracrine 旁泌 在局部起作用激素 endocrine 内分泌 经血到远隔器官起作用相同点 细胞产生 分泌 作用受体 放大作用 细胞因子与激素的运行机制不同 举例局部损伤 细胞产生因子 只对局部细胞产生影响 如象激素一样入血 对全体细胞都产生影响 就麻烦了 细胞因子种类很多 作用广泛 与细胞外基质也有着密切的联系 下面仅就常见的细胞因子作以简介 Wnt通路中的关键分子与肺癌侵袭转移 王恩华中国医科大学 研究背景1 在中国肺癌的发生率在过去的30年里上升了465 死亡率居恶性肿瘤之首每年死于肺癌的患者约45万人 其中约有40万人死于肺癌的转移因此揭示肺癌侵袭转移的分子机制和寻找治疗关键靶点 具有重要意义 研究背景2 Wnt通路中的关键分子GSK 3B APC和B catenin与肿瘤侵袭转移的关系已有较多报道 而位于其上游的DVL和Axin是如何调控肿瘤侵袭转移的则少有报道与B catenin同一家族的p120ctn是否与Wnt通路有关尚不清楚已有报道p120ctn能与Kaiso结合 而Kaiso只有入核信号 没有出核信号 那么p120ctn是否具有调节Kaiso核浆分布的作用 进而影响肿瘤的侵袭转移尚无报道 catenin在正常支气管上皮细胞表现为膜表达 而在NSCLC中主要表现为细胞浆或核内的蓄积 这种蓄积与NSCLC的低分化和淋巴结转移相关 1 Axin对NSCLC中 catenin蓄积所起的作用 我们用SSCP和直接测序法检测了100例NSCLC中 catenin第三外显子突变情况 结果发现 catenin的第三外显子无一例突变AmJClinPathol 2006 125 4 534 541 是什么原因造成了 catenin在肺癌细胞中的蓄积 我们发现Axin在NSCLC中的表达明显下调 Axin的表达下调与NSCLC的不良预后明显相关 转染Axin可明显抑制肺癌细胞的侵袭转移和增殖能力 过表达Axin可使肺癌细胞中高表达的 catenin出现明显下调 我们猜测 Axin的表达减少可能是导致 catenin在NSCLC中蓄积的原因之一AnnSurgOncol2007 14 3251 9 我们将新鲜的NSCLC组织经1grayX ray照射后发现Axin的蛋白和mRNA均出现了明显的上调 同时Caspase 3的表达也出现了明显的上调 既然Axin有如此明显的抑癌作用 如何上调Axin的表达呢 因此 X ray是否能上调Axin的表达及水平是判定NSCLC是否对X ray治疗敏感的有用指标 X ray照射或转染Axin都能上调肺癌细胞的凋亡率 转染Axin加上X ray照射可使凋亡率明显增加 Axin诱导细胞凋亡的机制是什么 转染Axin或不与p53结合的 Axin 再用p53抑制剂PFT 或JNK抑制剂SP处理 结果发现Axin通过p53和 或JNK通路促进肺癌细胞凋亡IntJRadioOncol2009 我们意外地发现 过表达Axin可以下调TCF 4的转录 但机制不清 已有文献报道 catenin具有促进TCF 4转录 而p53具有抑制TCF 4转录的能力而Axin既具有下调 catenin的能力 又有激活p53的能力因此 Axin既有可能是通过 catenin 也有可能是通过p53下调TCF 4的转录 我们为了探讨这个问题 构建了Axin不能与 catenin结合 Axin不能与p53结合 以及Axin既不能与 catenin也不能与p53结合的突变体 转染Axin在下调 catenin表达的同时可明显下调TCF 4的表达 但转染Axin ca即保留了p53作用时却不能下调 catenin和TCF 4 但由于BE1细胞系是p53突变型细胞系 因此尚不能确定Axin是否具有通过p53下调TCF 4的作用因此 我们向BE1细胞中转染了野生型p53 结果显示单纯转染野生型p53可以下调TCF 4 但共转染Axin ca和p53后TCF 4并没有出现进一步下调 表明Axin并不能加强p53下调TCF 4的作用 MolCancer 2010Feb2 9 25 二 DVLs对Wnt通路的调节作用非小细胞肺癌组织中存在DVL 1和3的过表达 其表达与高TNM分期 低分化有关 Dvls在淋巴结转移灶中的表达总是高于原发灶Dvl 1和Dvl 3的过表达与非小细胞肺癌的不良预后相关 LungCancer 2008 62 181 192 我们发现 过表达Dvl 1可以明显的上调 catenin的蛋白水平 同时激活TCF 4依赖的转录活性 表明Dvl 1主要参与经典的Wnt通路而过表达Dvl 3却不能明显上调 catenin水平和TCF 4依赖的转录活性但无论过表达Dvl 1还是Dvl 3均能明显增强肺癌细胞的侵袭转移能力 我们发现 转染Dvl 3能明显上调肺癌细胞中磷酸化的JNK和p38水平 那么Dvl 3是怎样促进肺癌细胞侵袭转移的呢 Molecularcarcinogenesis 2010 并且明显下调RhoA的活性 上调Cdc42和Rac1活性 由于小GTP酶活性和JNK p38均与非经典的Wnt通路有关 因此我们可以得出如下结论 Dvl 1主要通过经典Wnt通路而Dvl 3主要通过非经典Wnt通路促进肺癌细胞的侵袭和转移 我们发现 过表达DVL 3上调p120mRNA水平 但是转染Dvl 1却不能 转染Dvl 3可以增加Pax6的表达 无论是应用Pax6的单克隆抗体阻断 还是用siRNA敲出Pax6 都可以明显的下调p120ctn的转录 ChIP分析证实了转录因子Pax6可以直接与p120ctn的启动子区结合 上述结果说明 Dvl 3调节Pax6 而Pax6又与p120ct的启动子区作用 进而启动了p120ctn的转录但Dvl 3是如何上调Pax6的尚不清楚 上述结果提示我们p120ctn通过Dvl 3与Wnt通路联系p120ctn与Wnt通路之间还存在哪些联系呢 3 p120ctn在肺癌侵袭和转移中的作用 及其与Wnt通路的联系 p120ctn在肺癌中的异常表达及意义 P120ctn的异常表达与低分化 高TNM分期 淋巴结转移及不良预后相关HistolHistopathol2006 21 841 847APMIS2007 115 848 56 肺癌中p120ctn 1A 3A和E cadherin的表达下调与smallGTP酶过表达相关 LungCancer63 2009 375 382 敲除p120ctn后 Pulldown结果证实cdc42 Rac1活性增强 但RhoA活性下降 E cadherin的蛋白表达下降 敲除p120ctn后S期细胞比例增加 侵袭和转移能力增强 CancerSci2009 100 441 448 过表达p120 1A下调Rac1活性而过表达p120 3A下调Cdc42活性 p120ctn 1A和3A都可抑制肺癌细胞增殖 侵袭和转移但是p120ctn 1A抑制肺癌细胞侵袭转移的能力强于3A而p120ctn 3A抑制增殖的能力明显强于1A ExpCellRes2009 315 890 898 我们发现 转染p120 1A可以明显的上调 catenin的蛋白和mRNA的表达 我们得出以下结论 p120ctn 1A通过 catenin与Wnt通路关联 用siRNA敲出p120ctn后 catenin的蛋白和mRNA水平出现明显下调 Kaiso是如何出核的 4 Kaiso在肺癌侵袭转移中的作用 Kaiso过表达与NSCLC不良预后相关 BMCCancer 2009 9 178 无论是在肺癌原发灶和淋巴结转移灶中 Kaiso和p120ctn总是呈现同样的表达部位 免疫共沉淀证实 无论在肺癌组织还是细胞系中 Kaiso和p120都可以形成复合体 干扰p120后Kaiso核内增多 核浆蛋白分离进一步验证Kaiso在核内分布增多 说明 p120无论在细胞浆还是在核内 都能与Kaiso结合 转染p120ctn 3A Kaiso和p120ctn主要为浆表达LMB阻断p120ctn出核则p120ctn和Kaiso主要位于核内转染p120 NLS 3A入核序列质粒则p120ctn位于核内 Kaiso也位于核内 我们得出结论 p120ctn 3A影响Kaiso的核浆分布 Kaiso的出核依赖与p120ctn 3A的存在 ExpCellRes revised 结论 Axin DVL p120ctn Kaiso在肺癌侵袭转移中发挥着重要的调控作用 catenin在NSCLC中蓄积是由于Axin表达下调所致 过表达Axin或用X线照射肺癌组织上调Axin的表达 都可明显抑制肺癌的侵袭转移 促进肺癌细胞凋亡P120与Wnt通路中的关键分子Dvl 3和 catenin相关Kaiso是通过与p120 3A结合被携带出核的 Publishedariticles directlyrelative 1 AxindownregulatesTCF 4transcriptionviabeta catenin butnotp53 andinhibitstheproliferationandinvasionoflungcancercells MolCancer 2010Feb2 9 25 2 CytoplasmicKaisoisassociatedwithpoorprognosisinnon smallcelllungcancer BMCCancer 2009Jun9 9 178 3 Kaisoisexpressedinlungcancer itsexpressionandlocalizationisaffectedbyp120ctn LungCancer2010 67 2 205 215 4 X rayinducesnon smalcelllungcancerapoptosisbyupregulatingAxinexpression InterJRadOnc Biol Phys 2009 75 2 518 265 Ablationofp120 CateninEnhancesInvasionandMetastasisofHumanLungCancerCells CancerSci 2009 100 3 441 448 6 Abnormalexpressionofp120 catenin E cadherin andsmallGTPasesissignificantlyassociatedwithmalignantphenotypeofhumanlungcancer Lungcancer 2009 63 375 382 7 P120 cateninIsoforms1Aand3ADifferentlyAffectInvasionandProliferationofLungCancerCells Expcellres 2009 315 5 890 898 8 Dishevelledfamilyproteinsareexpressedinnon smallcelllungcancerandfunctiondifferentiallyontumorprogression LungCancer 2008 62 2 181 199 Reductionofp120 ctn isoforms1and3issignificantlyassociatedwithmetastaticprogressionofhumanlungcancer APMIS 2007 115 7 848 56 10 OverexpressionofAxinDownregulatesTCF 4andInhibitstheDevelopmentofLungCancer AnnSurgOncol 2007 14 11 3251 9 11 Abnormalbeta cateninandreducedaxinexpressionareassociatedwithpoordifferentiationandprogressioninnon smallcelllungcancer AmJClinPathol 2006 125 4 534 541 12 Abnormalexpressionandclinicopathologicsignificanceofp120 catenininlungcancer HistolHistopathol 2006 21 8 841 847 13 ExpressionofTcellfactor 4innon smallcelllungcancer ChinMedJ 2005 118 2 136 40 14 Connexin43recruitsE cadherinexpressionandinhibitsthemalignantbehaviouroflungcancercells FoliaHistochemCytobiol 2008 46 3 315 21 15 Expressionofserinethreoninekinase15isassociatedwithpoordifferentiationinlungsquamouscellcarcinomaandadenocarcinoma PatholInt 2006 56 7 375 380 是由细胞产生或分泌 对细胞生长 分化等具有显著调节作用的多肽目前已发现的生长因子已有50多种 并有新的因子的报道 其中部分生长因子的结构与生物学活性已基本搞清 有的已商品化 并在临床上得以应用 一 生长因子growthfactor 意义对各类生长因子的广泛深入的研究 将有助于人类对胚胎发育 组织与器官的形成等基本生物学问题的认识 如干细胞 同时对肿瘤 血管疾病的诊断治疗以及对创伤修复技术的提高等都将产生巨大的影响 一 生长因子分类生长因子种类繁多 来源复杂 结构各异 生物学作用与其它细胞因子间又有交叉 因此 单靠一种分类方法是不足以反应生长因子的本质和作用机制的 目前的分类方法有以下几种 1 根据生物学效应 细胞生长促进因子 细胞生长抑制因子 生长抑素注意同一种生长因子 对不同的组织细胞或同一种组织细胞的不同生长阶段 可有相反的作用如转化生长因子 TGF 早期纤维母细胞生长 晚期起抑制作用 对细胞的增殖既有促进又有抑制 2 根据理化特性 单链多肽 表皮生长因子EGF 含糖链的多肽二聚体蛋白 PDGF 糖蛋白 集落刺激因子CSF和白细胞介素IL 3 根据其作用细胞类型 单价因子 一种因子只作用于一类细胞 多价因子 一种因子可作用于不同类型细胞 4 按其作用效果 增殖因子 IL 2 IL 3 GM CSF BCGF 分化因子 IL 2 IL 3 BCGF IFN 效应因子 TNF 二 生长因子作用的靶细胞范围随着对各类生长因子的认识不断加深 发现生长因子的作用和作用范围都较原来发现时广得多 宽得多举例在免疫细胞中分离出来IL I 起初认为是调节免疫系统的信号分子 后来发现 还对角质细胞 f母细胞 星状细胞 软骨细胞有作用 另外从非免疫细胞中分离出来的转化生长因子TGF 却有着很强的免疫调节作用 在抑制T细胞功能上要比环孢霉素至少强10倍 同时也有很强的抑制B细胞合成免疫球蛋白的作用 因此 它是在器官移植方面 一个非常好的生物制剂 三 生长因子作用的处境依赖性生长因子的作用及作用强度是视其周围环境条件而定的 即依赖于受体和其它效应分子的存在举例TGF 在EGF存在时 对f母细胞的生长起抑制作用TGF 在PDGF存在时 对f母细胞的生长起促进作用另外TNF在IL 1和TGF 存在时才发挥作用因此要辩证地看待生长因子作用的广泛性 可变性 四 生长因子与原癌基因产物的关系绝大多数原癌基因产物已被证明都是与细胞生长 增殖 分化有关的蛋白质 现已搞清 生长调控基因与原癌基因 在很大程序上就是一回事举例sis基因表达产物与PDGF的B链有92 的同源性 erbB基因产物与EGF受体高度同源所以 在一定程度上讲 癌蛋白就是生长因子 受体 细胞内信号转导因子或DNA结合蛋白 五 生长因子的临床应用生长因子参与了炎症 血管新生 损伤修复和肿瘤的发生发展 在肿瘤形成中起关键作用的生长因子 在炎症 损伤修复中 却是一种正常的反应性的生理表达 这种表达也是至关重要的 目前应用 TGF 用于抑制免疫反应和排斥反应 bFGF用于抑制肿瘤内血管形成 GM CSF用于再障或放化疗后几乎每种生长因子都可用基因重组方法生产 未来的10年将是生长因子从基础到临床过渡的10年 几种常见的生长因子 1 血小板源生长因子platelet derivedgrowthfactorPDGF 最初是在血小板中发现的一种促分裂剂1 这一名称不够准确 因为血小板可产生许多生长因子 血管内皮细胞生长因子vascularendothelialgrowthfactor VEGF 表皮生长因子epidermalgrowthfactor EGF 转化生长因子transforminggrowthfactor TGF 2 另外 许多细胞都可产生PDGF如VSMC 表皮细胞 皮肤f母细胞 肿瘤细胞PDGF分子量为28 35KDa 由A B两条链组成 B链与sis原癌基因编码蛋白有92 同源性体内存在形式 PDGF AAPDGF BBPDGF ABA链与A受体结合B链即能与B又能与A结合购买抗体时应注意实验的组织或细胞上是否存在被检受体 生物作用 诱导细胞增殖 是一种强促有丝分裂剂 趋化作用 引起间充质细胞 单核细胞 中性粒细胞 定向迁移及释放颗粒 引起 型胶原的合成和分泌 调节细胞外基质 PDGF的临床意义1 创伤修复创口处血小板沉积 PDGF 中性WBC 单核 巨噬C内移清除异物 capf母细胞 SMC 内移 增生 肉芽 填补伤口capf母细胞 SMC释放PDGF C T增生 增加胶原沉积 愈合 举例Knighton采用病人自身血小板释放物质 PDGF 处理因糖尿病出现的难愈合的皮下溃疡 使濒于截肢危险的溃疡得到了愈合 2 动脉粥样硬化形成及血管再狭窄动脉内皮细胞血小板增殖 内膜增厚 SMC收缩型 分泌型 胶原沉积 硬化PTCA血管移植 PDGF VSMC游走 分裂 PDGF SMC游走 增殖 再狭窄 restenosis 设想 用单克隆抗体中和局部产生的PDGF在动物及细胞培养上获得成功 但用于人体 给药途径受到限制 antisenseRNA局部转染 可以研究探讨 抑制疤痕形成 中和抗体和反义RNA技术等 但应注意PDGF的作用 不是孤立的 它是在其它细胞因子和生长因子也参与细胞反应的复杂环境中发挥其作用的 也就是说 抑制了PDGF的作用只是一个方面 而其它的因子仍然在起作用 在判定实验结果时 要综合进行考虑 2 纤维母细胞生长因子fibroblastgrowthfactor最初是在脑和垂体中发现 对纤维母细胞有促分裂作用而命名的 FGF本身种类繁多 由于制备方法和来源不同给予许多特殊命名 因此 极易混淆 如肝素结合生长因子等 多数人认为 按其等电点分为两类比较合适 即aFGF和bFGF FGF与原癌基因hst int 2编码的蛋白有很大同源性来源f母c 血管内皮C SMC 粒C 肾上腺皮质C 星形胶质C 肿瘤细胞等 生物作用 强的血管生长因子 诱发新生cap作用 促进创伤愈合和组织修复 参与胚胎发育和分化 刺激外周神经再生和营养神经的作用 调节内分泌的作用 FGF的临床意义 创伤愈合FGF用于治疗胃溃疡方面的尝试最多 但由于FGF不稳定 全身投与很难达到胃溃疡部位 直接口服由于胃酸的破坏使其作用大大减弱办法 FGF可与肝素结合 不仅稳定 且耐酸 耐热 可获较好的效果 肿瘤治疗实体肿瘤无一例外均能产生FGFautocrineautointra factorparacrine 血管生长 自身增殖 举例 利用bFGF单抗中和FGF 达到对肿瘤的治疗 在动物体内获成功 苏拉明阻止bFGF与受体结合 达到了对肿瘤的抑制 设想 用人的bFGF单抗和受体单抗 结合介入局部给药 或放入支架制成缓释剂 结合介入 局部给予反义RNA 基因治 内皮支架基因表达 促进侧枝循环的形成大面积心梗最令人担心的是猝死 但经抢救免于一死 也担心心脏破裂或室壁瘤的出现 如何加强梗死部位的强度 最好的方式就是能尽快机化 而bFGF是一种强的新生Cap生成因子 国外在狗模型中证实给梗死部位血管内注入bFGF 很快使梗死面积缩小 组织学上有较多的侧枝循环的出现 说明FGF用于治疗心梗方面可望成为可能 血管再狭窄PTCA bFGFPDGF SMS增生 restenosis设想 狗 介入球囊 心梗模型 冠状血管狭窄模型放置 注入bFGF 心梗缩小 注入bFGF抗体 狭窄减轻反义RNA 周围神经再生脊髓损伤 bFGF促进神经纤维膜细胞生长 轴突长入 3 表皮生长因子epidermalgrowthfactorEGF是一个较早被发现的生长因子 EGF基因与V mos原癌基因有部分同源性 EGF受体基因与erbB 1基因有75 以上同源性 在人体主要存在于各种体液或分泌物中 促进愈合 其中前列腺液 乳液中最高 除表皮细胞外 对许多细胞都有促进生长作用 应用 细胞培养 培养液中加入EGF 角膜损伤修复 在动物角膜上早获成功 将EGF制成点眼液 使角膜烧伤无法愈合 只留光感的患者 几周后恢复正常 皮肤创伤愈合1 植皮病人 加用EGF明显达到了促进创面愈合的目的2 EGF体外培养自体表皮或表皮细胞 繁殖到一定数量后 将培养好的表皮植入创面 或将培养的表皮细胞象播种一样撒在创面 不仅加快愈合 也减少了疤痕产生 二 白细胞介素interleukins为淋巴因子家族中一类 是联系白细胞间相互作用的细胞因子 共有18种 IL1 13研究的比较多 IL14 18是最近才被命名的主要生物学作用 1 参与免疫反应在移植物排斥反应 哮喘疾病发生 肿瘤免疫中均起重要作用它们的作用相互协同而加强如IL 1BC增殖 分化 产生抗体TC产生IL 2及IL 2受体IL 4 5可协同加强IL 1对BC的作用 2 参与炎症反应IL 1使机体发热 外周WBC升高 促进内皮细胞表达粘附分子 增进WBC与之粘附IL 8是中性WBC趋化因子和激活因子IL 12是T NK细胞等免疫效应细胞的促进因子 具有抗寄生虫 病毒和细菌和抗肿瘤等功能 3 参与损伤修复IL 1与酸性FGF有同源性 促进血管新生IL 2可使f母C数量增加 4 抗肿瘤作用IL 12使NK细胞激活使CD8 T细胞 细胞毒淋巴细胞CTL这已在IL 12转基因动物研究中得到证实IL 2使T细胞 淋巴细胞激活的杀伤细胞LAK细胞从外周血分离TC 经IL 12 2作用后 回输给病人 抗肿瘤作用 白细胞介素功能很多 作用极强 相互间有重叠 诱导交叉 协同和拮抗 需要进一步研究的方面较多 但抗病毒 抗肿瘤和免疫调控作用是肯定的 目前 绝大多数IL可用基因工程方法生产 相信不久将广泛用于临床为人类造福 三 细胞粘附分子celladhensionmoleculesCAMSConcept 是一群在多种细胞上表达 介导细胞间粘附和具有传递信息作用的糖蛋白物质分为以下5类钙离子依赖型蛋白家族cadherinfamilyCF主要参与特定组织和器官细胞间粘附 胞内段与细胞骨架联结 因此较牢固 可以想象 如肝细胞