培养基的灭菌.doc

一、 常用培养基配置及灭菌一、实验目的1了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；2了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。 3学习高压蒸汽灭菌的操作方法。二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。1、热力灭菌：利用高温使菌体蛋白质变性或凝固，代谢发生障碍， 导致细菌死亡。包括：（1）焚烧法：用火焚烧，是很彻底的灭菌方法，适用于废弃的污染物品和有传染性的动物尸体等。（2）烧灼法：直接再火焰上烧灼，用于接种环(针)和试管口或瓶口的灭菌。（3）干烤法：在干烤箱通电后利用高热空气进行灭菌。一般加热160-170， 维持2小时即可杀灭包括芽胞在内的一切微生物。主要用于玻璃器皿、 磁器或需干燥的注射器等。（4）煮沸法：煮沸1005分钟可杀死细菌的繁殖体，一般消毒以煮沸10分钟为宜。如需要杀死芽胞则要煮沸1-3小时。主要用于一般外科器械、注射器、胶管和食具等的消毒。（5）间歇灭菌法：是利用反复多次的流通蒸汽， 杀死细菌所有繁殖体和芽胞的一种灭菌法。本法适用于耐热物品，也适用于不耐热(100)的一些物质如某些培养基的灭菌。具体做法是将待灭菌的物品置于阿诺氏流通蒸汽灭菌器内，100加热15-30分钟杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置37温箱中过夜，使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽加热，如此连续三次，可将所有繁殖体和芽胞全部杀死。若有某些物品不耐100，则可将温度降至75-80， 每次加热的时间延长至30-60分钟， 次数增至3次以上，也可达到灭菌目的，如用血清凝固器对血清培养基或卵黄培养基的灭菌。（6）巴氏消毒法：由巴斯德创建，常用于牛奶和酒类的消毒。一般加热61.1-62.8半小时， 或71.7经15-30秒钟， 便可达到杀死病原菌或一般杂菌， 而不严重破坏物品的质量的目的。（7）高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。利用高压蒸汽灭菌器锅进行灭菌，由于密闭容器加温所产生的高压饱和水蒸汽能获得较高的温度，通常在1.05kg/cm2的压力下， 温度达121.3， 维持15-30分钟， 可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。此法适用于高温和不怕潮湿物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、手术器械、注射器、手术衣、敷料和橡皮手套等。在同样温度下， 湿热灭菌的效果比干热灭菌好， 原因是：A、湿热中菌体吸收水份， 蛋白质较易凝固。B、湿热比干热的穿透力好， 这主要是由于水或饱和水蒸汽传导热能的效率明显高于空气。蒸汽容易穿透到物体的深部， 使灭菌的物体内部温度迅速上升。C、蒸汽有潜热存在。每一克水在100时， 由气态变为液态可放出529卡的热量。当蒸汽与被灭菌的物体接触时凝结成水， 放出潜热， 能迅速提高灭菌物体的温度。2、紫外线灭菌：紫外线杀菌原理是通过干扰细菌DNA的合成， 波长2650-2660A杀菌力最强。无菌室缓冲间和接种箱常用紫外线灯作空气灭菌。无菌室和缓冲间的照射时间为2050分钟（视房间大小而定），接种箱照射1015分钟即可。为了加强紫外线灭菌的效果，在照射前，可在无菌室、缓冲间或接种箱内喷洒5%石炭酸，以使空气中附着有微生物的尘埃降落，同时也可以杀死一部分微生物。无菌室的工作台的台面和椅子，可用23%的来苏儿擦洗。然后再照射紫外线。由于紫外线对人体有伤害作用，所以人不要直视正在照射的紫外线灯，也不要在照射情况下进行工作。灭菌后，为了检验紫外线的灭菌效果，可以在无菌室、缓冲间或接种箱内放一套盛有培养基的培养皿，将皿盖打开510分钟，盖好后，放入温箱中培养。如果只有一、二个菌落，可认为灭菌效果良好。如杂菌丛生。则需延长照射时间或同时加强其它灭菌措施。紫外线作用的特点是(1)穿透力弱，只能用于房间空气、物体表面消毒；(2)杀菌效果与照射时间，距离和强度有关；(3)对眼睛角膜和皮肤有损伤作用，工作人员切勿在紫外线灯照射下进行操作。三、实验器材1器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。2试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂四、实验流程 称药品溶解调pH值融化琼脂过滤分装包扎标记灭菌摆斜面或倒平板五、实验步骤1培养基的制备 1）称量药品 根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2）溶解 用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。 3）调节pH 根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。 4）溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。 5）过滤分装 先将过滤装置安装好。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。 6）包扎标记 培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。 7）灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121 20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。 8）倒平板 将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到4550,立刻倒平板1、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）牛肉膏3g蛋白胨5g氯化钠10g琼脂1520gpH7.07.2水1000mL 121灭菌20min。2、马铃薯培养基（简称PDA）（培养真菌用）马铃薯200g蔗糖（或葡萄糖）20g琼脂1520gpH自然 培养基的配制：马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，熔化后补足水至1000mL。121灭菌30min。2高压灭菌操作步骤1）首先将内层灭菌桶取出,再向外层锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。2）放回灭菌桶,并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤,以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触,以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3）加盖,并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气。4）用电炉或煤气加热,并同时打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后,关上排气阀,让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时,控制热源,维持压力至所需时间。本实验用 105kg/cm2,1213,20分钟灭菌。5）灭菌所需时间到后,切断电源或关闭煤气,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至0时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。如果压力未降到0时,打开排气阀,就会因锅内压力突然下降,使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口,造成棉塞沾染培养基而发生污染。6）将取出的灭菌培养基放入 37温箱培养24小时,经检查若无杂菌生长,即可待用。六、实验结果检查培养基灭菌是否彻底。七、思考