食用菌病虫害试验技术.doc

食用菌病虫害试验技术第一节 病害综述食用菌像其它栽培植物一样，只有在适宜的条件下才能进行正常的生理活动，才能生长发育良好。当其受到其它生物的侵染或者不适宜的环境条件超越了它们的适宜范围，食用菌就不能正常地生长和发育，即发生了病害，表现出不同程度的病态，严重的死亡。食用菌病害对食用菌的生理活动的干扰和破坏是多方面的，如：竞争性杂菌与食用菌竞争养分和空间，使食用菌营养缺乏，生长不良。此外，有些杂菌还会分泌毒素，干扰了食用菌正常的生理代谢活动。食用菌发生了病害一定会发生一定的病理变化程序，无论是非侵染性病害还是侵染性病害，都是首先在受害部位发生一些外界观察不到的生理活动变化，细胞和组织随后也发生变化，最后发展到外部可以观察到的病变，这就构成了病害的症状。病害表现得症状是寄主 内部发生一系列变化的结果。第二节 食用菌病害的症状类型菌洼：菌洼为盖上或菇盖里的深色洼，每个洼上带有粘液，坑洼的周围低洼变色。菌斑：也称褐斑。为菇盖上由黄变成淡棕褐色的区域。此色变是由表及里的延伸，很少超过2或3 毫米。霉病：为长在覆土的霉菌，其能封锁住蘑菇生长的通路，引起腐烂。猝倒：食用菌的菌病受害。侵染的菌柄髓部萎缩变成褐色，菇体变小且不再长大。畸形：食用菌受到病原物侵染时，生长发育不良，子实体生长发育不协调，产生不正常的畸形菇。如出菇感染病毒后，产生“鼓槌状”的子实体。蘑菇干泡病引起“唇裂”和幼菇感染形成“洋葱”菇。我们可以根据以上症状对食用菌病害进行识别，从而进行分离和培养。第三节 食用菌病原物的分离和培养食用菌病原物经常与其它微生物一起生存在罹病寄主表面或组织中。如果我们要鉴定和研究这些病原菌，最好是经过分离和培养工作，将它们从罹病组织中单独分离出来，并供给适当的条件，使它们繁殖获得纯培养物。1、组织分离法 食用菌侵染菌真菌性病害一般都是采用组织分离法。即切取小块病组织，经表面消毒和无菌水水洗后，移到琼脂培养基上培养。具体操作步骤如下：（1）取灭过菌的培养皿，将溶化并冷却至45的PDA培养基倒入平皿内（每皿大约25ml）制成平板。（2）取两个小烧杯，其中一个装70% 酒精，另一个装0.1% 升汞水；另取三付灭过菌的培养皿，分别倒入15ml左右的灭菌水。（3）选取新鲜病菇，先在70%酒精中浸泡2-3秒钟，消除附在寄主表面的气泡，然后移入0.1%的升汞溶液中消毒1分钟，并在3个盛有无菌水的培养皿内换洗三次，除去残留的消毒剂。（4）把消毒好的病菇用无菌吸水纸吸干后，在无菌条件下，在病健交界处切取一小块移植到平板上。在皿盖上标明分离材料、日期。倒置于25-28的温箱内培养。（5）待长出菌落时（约2-3天），用接种钩将病菌培养物挖取一小块移入PDA斜面上继续培养。2、直接挑取法对一些肉眼可见的杂菌，直接用接种针或接种环挑取少量病菌的菌丝，移入PDA斜面进行培养。如果是对罹病子实体中的病菌进行分离可用如下方法进行分离：将双手用75%的酒精擦洗，子实体也用75%的酒精擦洗，待酒精干后，用双手拿取子实体靠近酒精灯火焰，将子实体用手掰开（切忌不可用刀切，以免断面染菌）。用手术刀等锋利刀片挖取一小块断面子实体组织，用接种钩挑取并移入PDA斜面中，放入适温下培养。这种分离方法可获得较纯的病原菌，分离成功率高。3、稀释分离法 病原细菌一般都采用稀释分离法。病原细菌在组织中的数量很大。稀释培养可使病原细菌与其它杂菌分开，形成分散的菌落，从而分离得到纯培养物。具体操作步骤如下：（1）将溶化后冷却至45的肉汁培养基倒入灭菌培养皿中制成平板。（2）取无菌培养皿，倒入10ml左右的无菌水。（3）用脱脂棉蘸取少量75% 的酒精擦拭新鲜病组织表面，进行消毒，无菌操作挖取一小块病组织至于上述无菌水中静置10-15分钟，使病组织中的细菌流入水中制成细菌悬浮液。（4）用火焰灭菌过的接种环蘸取少量细菌悬浮液在平板上划线；培养皿上标明分离材料、日期，倒置28左右的温箱内培养，经1-2天形成菌落，用接种环挑取单个菌落移植于肉汁斜面培养基中继续培养。第四节 食用菌侵染性病害的观察鉴定我们对分离得到的病菌纯培养物进行观察，对病菌种类作出鉴定一 宏观鉴定1、真菌病害的宏观鉴定食用菌真菌病害（除酵母菌）在生长1-2天可见原菌块上有菌丝萌发出来并向新的培养基上生长的现象。菌落圆形，边缘整齐或有缺刻。3-4天有的真菌可见菌落有明显颜色变化，此颜色多为真菌孢子的颜色。2、细菌性病害的宏观鉴定纯培养的细菌菌落不会有菌丝生长，细菌菌落特征一般为表面光滑，有油腻感。二 微观鉴定采用显微镜观察对分离的纯培养病原菌进行细致的鉴定1、对于真菌性病害得显微观察制片方法有扦片法、玻璃纸法、印片法。下面主要对经常采用的扦片法进行介绍。（1）倒平板 去溶化并冷却至45左右的PDA培养基20ml倒平板，凝固待用。（2）接种 用接种钩挑取一小块培养物放入平板中间。（3）扦片 以无菌操作用镊子将灭菌的盖玻片在离接种块1.5cm左右， 以大约45角扦入琼脂内。扦片数量可根据需要而定。（4）培养 将扦片平板倒置，28培养。待菌丝爬到盖玻片1/2至2/3处时，可进行镜检。（5）镜检 用镊子小心拔出盖玻片，擦去背面培养物，然后将有菌的一面朝上放在载玻片上，直接镜检。直接镜检可见到孢子立体着生现象，但不能对菌丝状态进行细致观察。直接镜检一般采用目镜10倍，物镜20倍进行观察，倍数太高，物镜有可能触碰到菌丝对显微镜保养不利。要对菌丝和孢子进行细致的显微观察可采用直接制片观察法2、直接制片观察法（1）在扦片上有菌的一面小心滴上少量50%以上浓度的酒精(滴酒精时一定要小心，不能冲坏菌丝)。滴酒精的目的是使菌丝与水充分接触，防止在盖盖玻片时产生气泡不利于观察。如果扦片上菌丝太厚可将扦片下部分的较厚菌丝层擦除。（2）在载玻片上滴一滴水或一滴乳酸石炭酸棉兰染色液，将盖玻片有菌的一面向下盖到载玻片的水或染液中。小心不要产生气泡。（3）观察 此时可在400倍镜下观察，孢子的形态、菌丝的形态都可很好的观察到。根据观察的现象，查找资料进行病菌的分类鉴定。3、对细菌性病害的微观鉴定主要采用染色法下面主要介绍常用的简单染色法和革兰氏染色法 （1）简单染色法操作步骤涂片滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，用接种环以无菌操作从斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。注：玻片要洁净，滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。干燥室温自然干燥。如果要烤干，则玻片要在酒精灯火焰上方，手不会感觉很热的位置烤干，温度太高会导致菌体变形，造成观察产生错误。固定涂面朝上，通过火焰2-3次。注：热固定温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。染色将玻片平放于玻片搁架上，滴加草酸铵结晶紫染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。染色约1min。水洗倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上留下的水物色为止。注：水洗时不要直接冲洗涂面，应使水从玻片的一段流下。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。干燥自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。镜检涂片干后镜检。注：涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。简单染色法只能看清菌体形态，不能判断是阳性菌还是阴性菌（2）革兰氏染色操作步骤制片取菌种培养物按简单染色法涂片、干燥、固定。初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。脱色用滤纸吸取玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。注：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20-30s。复染用番红液复