靶向PCR CTC检测技术.ppt

靶向PCRCTC检测技术 帮助临床医生更全面地评估肺癌 LungCancerinSolidTumorinChina 液态活检通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基因组信息来评估肿瘤 病理活检通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤 CTCctDNAmircoRNALNCRNAOthers 传统的组织细胞学检测 液态活检在肺癌中的应用 治疗策略 事件 疑似肺癌 辅助诊断 早癌肺癌 晚期肺癌 癌症耐药 复发监测 治疗方案选择 耐药机理新药研发 CTC的临床应用价值 疗效评估 CTC 数量 负向富集 靶向PCR ctDNA 基因变异 1 K Pantel etal NatRevClinOncol 2009 2 K PantelandMR Speicher Oncogene2015 什么是循环肿瘤细胞 CirculatingTumorCell CTC 肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少 可间接反应肿瘤发生发展的功能状态 CTC 在肿瘤发生过程中 具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞 均由原发肿瘤脱落释放入外周血 两者统称循环肿瘤细胞 CirculatingTumorCell CTC1 CTC 有转移 侵入第二器官CTCs 称之为DTC disseminatedTumorCell 只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微转移灶 逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2 什么时候可以检测到CTC 早期肿瘤外周血中即可检出CTC WHe etal ProcNatlAcadSci 2007 早期肿瘤外周血中即可检出CTC 表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB c小鼠的背部侧面移植2周后 在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1 4个CTC细胞移植后第3和第4周 则每分钟可分别检测7个和18个CTC 随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升在肿瘤移植的前4周内 没有在任何组织切片中发现到存在转移性癌症的迹象 CTC富集技术密度与大小免疫磁珠 负向富集or阳性富集 微流体 CTC检测方法 CTC检测技术靶向PCR免疫荧光普通PCR 方法 收获 垃圾 蟹饵 没水了 我们躲不了了 放水 负向富集 优势 回收率100 劣势 纯度略低 幸好没贪嘴 我们逃了 方法 收获 垃圾 没水了 我们躲不了了 放水 负向富集 优势 回收率100 劣势 纯度略低 幸好没吃胖 我们逃了 网筛 CTC检测技术检测原理 负向富集 靶向PCR FR阳性靶标 肺癌细胞FR 叶酸受体 高度表达CTC FR 1 50万EMT转化不影响FR丰度其他血细胞不表达FR CTC回收率接近100 磁珠富集易操作和自动化 灵敏度超高 负向富集可满足检测要求信号二次放大 1个CTC信号放大10 12倍无需人工经验判读 结果客观准确可实现CTC的定量 CTC检测靶向PCR 信号放大 保证高度敏感性 1个CTC信号放大1012倍 CTC检测 优势一 阴性富集不丢失循环肿瘤细胞 优势二 靶向探针特异性高 优势三 PCR扩增信号 确保高敏感性 优势四 PCR仪判断CTC技术 避免人为误差 3mL血 1mL 3mL血 3mL血 1个CTC 3mL血 50万FR 1个CTC 1个CTC 1slide 100万信号 1个FR 1个信号 1个CTC FR靶向PCR 1个CTC细胞信号方法10 12倍 万亿倍 细胞免疫荧光 1个CTC细胞信号几乎没有放大 CellSearch 正向富集 免疫荧光技术进行捕获和鉴定 16 EpCAM 上皮细胞粘附分子APC 异藻蓝蛋白荧光染料CK 细胞角蛋白PE 藻红蛋白荧光染料DAPI 4 6 二脒基 2 苯基吲哚 DNA荧光染料 EpCAM阴性细胞中 存在大量CTC CellResearch系统主要使用EpCAM 上皮粘附分子 做为探针研究证实 EpCAM阴性的细胞中也存在CTC JiataoLou etal PlosOne2013 2004 CellSearch 乳腺癌中检测出 但肺癌敏感性低 2011 CellResearch 采用的抗体 EpCAM 对EMT细胞特异性差 而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程 3mL血 6个小时 得到报告 检测流程 肺癌领域 CTC检测技术对比 不同CTC计数对于肺癌诊断的特异性与敏感性 CTC对肺癌的诊断显著优于一般肿瘤标志物 CTC与一般肿瘤标志物对肺癌诊断的准确性 AUC值 单项CTC检测的辅助诊断价值优于多个一般肿瘤标志物联合 AUC 0 91 P 0 0001 AUC 0 76 不同病理类型中 CTC辅助诊断价值均优于一般肿瘤标志物 CTC肺癌辅助诊断小结 CTC反应肺癌发生发展功能状态 肺癌辅助诊断价值显著优于一般肿瘤标志物靶向PCRCTC技术 所有肺癌敏感性提高3倍 I期肺癌提高10倍 CTC 用于化疗疗效评估 先于肿瘤大小发生变化 评估肿瘤功能状态 NSCLC 1st linecarboplatin paclitaxel d NSCLC 2nd linepemetrexed e BaselineCTscanswerebeforetherapyinitiationandCTCmeasurementsbeganatorshortlyafterthefirsttreatment CTC数量变化与RECIST标准基本一致 FR靶向PCRCTC检测与肺腺癌患者一线培美曲塞化疗疗效相关 培美曲塞是一种抗叶酸制剂 通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程 抑制细胞复制 从而抑制肿瘤的生长FR靶向PCRCTC检测技术特异性检测循环肿瘤细胞表面叶酸受体含量研究数据发现 接受一线培美曲塞化疗的肺腺癌患者治疗前CTC水平越高 ORR与PFS越好叶酸受体表达量与培美曲塞治疗效果正相关 Cutoff为16cu 3ml 高表达患者的ORR明显优于低表达者 CTC 16 8 12 75 患者PR DCR100 8 7 CTC 16 1 9 11 患者PR CTC 16 PFS448天8 7 CTC 16 PFS94天 Cutoff为16cu 3ml 高表达患者的PFS明显优于低表达者 总结 靶向PCRCTC检测技术敏感度最高 反应肿瘤发生发展的功能状态 可做为新一代肿