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作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010 36 9 1440 1449 http www chinacrops org zwxb ISSN 0496 3490 CODEN TSHPA9 E mail xbzw 本研究由国家自然科学基金项目 30800077 资助 第一作者联系方式 E mail biowxr Tel 020 89003226 Received 收稿日期 2010 03 10 Accepted 接受日期 2010 04 23 DOI 10 3724 SP J 1006 2010 01440 含异位表达花生 AhNCED1 基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力 万小荣 1 莫爱琼2 郭小建1 杨妙贤1 余土元 1 曹锦萍1 1 仲恺农业工程学院生命科学学院 广东广州 510225 2 仲恺农业工程学院教学科研基地 广东广州 510225 摘 要 AhNCED1 是干旱胁迫下调控花生 ABA 生物合成的关键基因 以 pCAMBIA1301 为基本双元表达载体 分 别构建 CaMV 35S 启动子和拟南芥 AtNCED3 基因启动子 AtNCED3p 驱动花生 AhNCED1 基因的 2 个植物双元表达 载体 p35S ORF 和 pAtNCED3p ORF 通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和 129B08 nced3 突变体拟南芥 经潮霉素筛选和 PCR 鉴定分别获得 35S ORF WT 和 A3p ORF B08 转基因植株 RT PCR 证实花生 AhNCED1 基因已在转基因植株中稳定表达 并对野生型 129B08 nced3 突变体和转基因拟南芥进行外源 ABA 敏感 性和耐渗透胁迫能力分析 结果表明 129B08 nced3 突变体对外源 ABA 的敏感性下降 而花生 AhNCED1 基因在拟 南芥中的异位表达提高了对外源 ABA 的敏感性 在山梨醇胁迫下 129B08 nced3 突变体种子的相对萌发率明显低于 野生型的 而 A3p ORF B08 转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当 显著高于 129B08 nced3 突变体的 且 300 mmol L 1山梨醇胁迫下 35S ORF WT 转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的 在 300 mmol L 1山梨 醇胁迫下 129B08 nced3 突变体幼苗叶片高度黄化 根的形成和幼苗生长受到严重抑制 而 A3p ORF B08 转基因突 变体与野生型相似 叶片仅轻度黄化 幼苗生长势良好 35S ORF WT 转基因植株幼苗生长未受明显影响 这些结果 说明 拟南芥 129B08 nced3 突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性 异位表达花生 AhNCED1 基因能恢复 该突变体对山梨醇的超敏性 提高拟南芥的耐渗透胁迫能力 关键词 AhNCED1 基因 异位表达 转基因拟南芥 渗透胁迫 ABA 敏感性 Osmotic Stress Tolerance Improvement of Arabidopsis Plants Ectopically Ex pressing Peanut AhNCED1 Gene WAN Xiao Rong1 MO Ai Qiong2 GUO Xiao Jian1 YANG Miao Xian1 YU Tu Yuan1 and CAO Jin Ping1 1 College of Life Sciences Zhongkai University of Agriculture and Engineering Guangzhou 510225 China 2 Teaching and Researching Base Zhongkai University of Agriculture and Engineering Guangzhou 510225 China Abstract The phytohormone abscisic acid ABA is a key regulator of seed development root growth stomatal aperture in higher plants and it is also involved in adaptation of plants to various stresses The oxidative cleavage of cis epoxycarotenoids catalyzed by nine cis epoxycarotenoid dioxygenase NCED is considered to be the rate limiting step in ABA biosynthesis in higher plants The AhNCED1 gene plays a vital role in the regulation of ABA biosynthesis in peanut plants in response to drought stress Two binary vectors p35S ORF and pAtNCED3p ORF were established which harbored the AhNCED1 gene respectively driven by the CaMV 35S promoter originated from pCAMBIA1301 and the AtNCED3 gene promoter from wild type Arabidopsis Wild type and 129B08 nced3 mutant Arabidopsis plants were separately transformed with Agrobacterium harboring p35S ORF or pAtNCED3p ORF vectors generating 35S ORF WT and A3p ORF B08 transgenic plants respectively after hygromycin screening and PCR detection The stable expression of AhNCED1 gene in Arabidopsis plants was confirmed by duplex RT PCR performance Wild type 129B08 nced3 mutant and transgenic Arabidopsis plants were subsequently tested for sensitivity to ex ogenous ABA and tolerance to osmotic stress The results showed that the ABA sensitivity of 129B08 nced3 mutant declined and that of Arabidopsis plants ectopically expressing the AhNCED1 gene increased Under sorbitol stress the relative germination rate of 129B08 nced3 mutant seeds was far lower than that of wild type seeds however the relative germination rate of A3p ORF B08 transgenic seeds was close to that of wild type seeds significantly higher than that of 129B08 nced3 mutant seeds The relative germination rate of 35S ORF WT transgenic seeds was higher than that of wild type seeds at the treatment of 300 mmol L 1 sorbitol Under 300 mmol L 1 sorbitol stress leaf of 129B08 nced3 mutant plants was highly chlorotic and root forma 第9期 万小荣等 含异位表达花生 AhNCED1 基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力 1441 tion and seedling growth were severely inhibited In contrast at this concentration of sorbitol leaf of A3p ORF B08 transgenic seedlings was only slightly chlorotic just similar to that of wild type plants the growth of 35S ORF WT transgenic seedlings was nearly not affected Germination assay and phenotypic evaluation revealed that 129B08 nced3 mutant was hypersensitive to the nonionic osmotic stress induced by sorbitol and that ectopic expression of peanut AhNCED1 gene reverted the hypersensitiv ity of 129B08 nced3 mutant Arabidopsis to sorbitol and conferred enhanced osmotic stress tolerance of transgenic Arabidopsis plants These observations and an improved understanding of the roles of AhNCED1 gene in stresses adaptation could provide the basis for engineering greater stress tolerance in crops Keywords AhNCED1 gene Ectopic expression Transgenic Arabidopsis Osmotic stress ABA sensitivity 花生 Arachis hypogaea L 是广东省主要的油料 和经济作物 在省国民经济中占有重要位置 广东 是我国南方花生产区播种面积最大 单产和总产最 高的省份 但其种植面积 60 以上分布在干旱 半干 旱地区 1 干旱胁迫成为提高花生产量和品质的主要 限制因子 2 脱落酸 abscisic acid ABA 作为一种胁迫激素 在植物对胁迫环境的适应中起重要调节作用 大量资 料表明 逆境条件下 植物体内源 ABA 含量增加 以提高抗逆性 3 近年来 已经明确高等植物 ABA 生物合成的主要途径 C40间接途径 可分为3个阶段 1 在质体内形成胡萝卜素 2 在质体内形成玉米黄 质 玉米黄质环化形成环氧类胡萝卜素 9 顺式新黄 质及 9 顺式紫黄质 然后 9 顺式新黄质或 9 顺式紫 黄质裂解形成黄质醛 3 黄质醛在细胞溶胶内转变 形成 ABA 4 5 生物化学 6 和遗传学 7 的实验结果证 明 9 顺式新黄质或 9 顺式紫黄质裂解形成黄质醛 是这一途径的限速步骤 催化该裂解反应的 9 顺式 环氧类胡萝卜素双加氧酶 nine cis epoxycarotenoid diox ygenase NCED 则是调控高等植物 ABA 生物 合成的关键酶 4 5 自从通过鉴定玉米突变体 vp14 进而克隆了 ZmVp14 基因 即 NCED 基因 以来 8 已 相继在番茄 9 菜豆 10 豇豆 11 美国鳄梨 12 拟 南芥 13 葡萄 14 柑橘 15 马铃薯 16 柱花草 17 龙胆 18 猪殃殃 19 云南菟丝子 20 玫红岩蔷薇 21 和柿果 22 中克隆鉴定了 NCED 基因 本实验室曾从 抗旱性强的花生品种叶中克隆到 NCED 基因 被命 名为AhNCED1 GenBank登录号为AJ574819 发现 其表达受脱水胁迫诱导 1 并证实 AhNCED1是干旱 胁迫下花生叶中调控 ABA 生物合成的关键基因 23 AtNCED3 基因调控水分胁迫下拟南芥中 ABA 生物 合成 13 24 129B08 nced3 突变体是 T DNA 插入到拟 南芥 AtNCED3 基因 At3g14440 外显子上所获得的 水分胁迫时 植株不能累积 ABA 对水分胁迫敏感 呈叶片萎蔫等表型 23 25 本文实验分别构建 CaMV 35S 启动子和拟南芥 AtNCED3基因启动子 AtNCED3p 驱动花生AhNCED1 基因的2个植物双元表达载体p35S ORF和pAtNCED 3p ORF 通过根癌农杆菌介导法将上述 2 个表达载 体分别转化野生型和 129B08 nced3 突变体拟南芥 经潮霉素筛选和 PCR 鉴定转基因植株后 并对野生 型 129B08 nced3 突变体和转基因拟南芥进行外源 ABA 敏感性和耐渗透胁迫能力分析 为通过植物基 因工程提高农作物抗旱性及农作物抗旱育种奠定实 验基础 1 材料与方法 1 1 植物材料 菌株和质粒 野生型 wild type WT 拟南芥 哥伦比亚生态型 Col 0 种子由本实验室繁种保存 129B08 nced3 突变 体拟南芥种子购自德国 GABI Kat http www gabi kat de 26 拟南芥 T DNA 插入突变体数据库 大肠杆 菌菌株 DH5 根癌农杆菌菌株 LBA4404 植物双元 表达载体 pCAMBIA1301 由本实验室保存 克隆载体 pMD 18 T 购自宝生物 TaKaRa 工程有限公司 1 2 植物双元表达载体构建 构建 p35S ORF表达载体时 选用 pCAMBIA1 301 为基本双元载体 以引物 ORF F 5 AGA TCT CAT GGC AGC AAC TTC AAA CAC ATG 3 和 ORF R 5 GGT CAC CAA TCA AGC CTG CTT CCG GAG ATC 3 扩增花生 AhNCED1 基因的完整 开放阅读框 open reading frame ORF 序列 根据克 隆需要在两引物的 5 端分别引入 Bgl II 和 BstE II 限 制性内切酶酶切位点 将PCR扩增产物克隆到pMD 18 T 载体上 得到 pMD 18 AhNCED1 克隆 测序验 证后 以 Bgl II 和 BstE II 双酶切 pMD 18 AhNCED1 质粒 回收酶切得到的 AhNCED1 ORF 片段 并连 接于同样经 Bgl II 和 BstE II 双酶切的 pCAMBIA 1301 载体 CaMV 35S 启动子下游 构建成植物双元 表达载体 p35S ORF 图 1 构建 pAtNCED3p ORF 表 达 载 体 时 根 据 GenBank 数 据 库 中 报 道 的 AtNCED3 基因组 DNA 序列 At3g14440 设计特异性 1442 作 物 学 报 第 36 卷 引物 A3p F 5 GAG CTC CAC CAG ACA ATT CAA AGT TA 3 和 A3p R 5 AGA TCT ACC ATT TTT CAA GTG TGT TCA 3 用于 PCR 扩增 AtNCED3 基因启动子片段 AtNCED3p 在两引物 的 5 端分别引入 Sac I 和 Bgl II 酶切位点 将 PCR 产 物克隆到 pMD 18 T 载体上 得到 pMD 18 AtNCED 3p 克隆 测序验证后 以 Sac I 和 Bgl II 双酶切 pMD 18 AtNCED3p 质粒 回收酶切得到的 AtNCED3p 启 动子片段 并连接于同样经 Sac I 和 Bgl II 双酶切的 双元表达载体 p35S ORF 花生 AhNCED1 基因上游 替换 CaMV 35S 启动子 构建成植物双元表达载体 pAtNCED3p ORF 图 2 1 3 拟南芥转基因 将 p35S ORF 和 pAtNCED3p ORF 表达载体分 别转化根癌农杆菌LBA4404 参阅Clough和Bent 27 的方法 以含 p35S ORF 表达载体的农杆菌转化野 生型拟南芥 得到的转基因植株称为 35S ORF WT 以含 pAtNCED3p ORF 表达载体的农杆菌转化 129B08 nced3 突变体拟南芥 得到的转基因植株称 为 A3p ORF B08 1 4 转基因拟南芥筛选与检测 1 4 1 以潮霉素筛选转基因拟南芥 收取转化后 拟南芥种子 消毒并在 0 1 的琼脂糖中重悬种子 均匀分散到潮霉素筛选培养基 1 2 MS 0 8 琼脂 25 g mL 1潮霉素 pH 5 8 上 4 均一化处理 2 3 d 后 置光下 22 暗处 20 的培养室中进行培养 光 周期为 16 h 光照 8 h 黑暗 约 10 d 后 将生长较快 的绿苗移栽到培养土中继续生长以收取种子 其余 图 1 花生 AhNCED1 基因过表达双元载体 p35S ORF 的构建 Fig 1 Establishment of binary vector p35S ORF harboring peanut AhNCED1 gene driven by CaMV 35S promoter 第9期 万小荣等 含异位表达花生 AhNCED1 基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力 1443 图 2 拟南芥 AtNCED3 基因启动子驱动花生 AhNCED1 基因的双元表达载体 pAtNCED3p ORF 的构建 Fig 2 Establishment of binary vector pAtNCED3p ORF harboring peanut AhNCED1 gene driven by AtNCED3 gene promoter 非转化黄苗在筛选培养基上逐渐死亡 为得到纯合 的转基因株系 取 T1代植株所收种子表面消毒后播 种于含 25 g mL 1潮霉素的琼脂培养基上 萌发两 周后 统计绿苗和黄苗的分离比例 T2代分离比 将绿苗移栽到土壤中 隔离单株收取种子 每株收 取的种子 T3 分别继续播种于含 25 g mL 1潮霉素 的琼脂培养基上 在平板上生长全部为绿苗的是含 至少一个插入位点的纯合转基因植株 1 4 2 转基因植株的 PCR 检测 提取拟南芥基 因组 DNA 用 AhNCED1 基因特异性引物 ORF F 及 ORF R 进行 PCR 扩增 检测呈阳性的为转基因植株 再参阅 Wan 和 Li 23 的方法利用 duplex RT PCR 检测 转基因植株中 AhNCED1 基因的转录水平 1 5 野生型 129B08 nced3 突变体和转基因拟南 芥对外源 ABA 的敏感性分析 将野生型 129B08 nced3 突变体及 35S ORF WT和A3p ORF B08转基因拟南芥种子消毒后播种 于附加 1 mol L 1 ABA 的 MS 固体培养基上 4 均 一化处理 3 d 后 按 1 4 1 的光照及温度条件培养 3 d 观察并拍照记录种子萌发情况 1 6 野生型 129B08 nced3 突变体和转基因拟南 芥对山梨醇的敏感性分析 将消毒后的野生型 129B08 nced3 突变体及 35S ORF WT 和 A3p ORF B08 转基因拟南芥种子 播种于含不同浓度 0 200 300 400 和 500 mmol L 1 山梨醇的 MS固体培养基上 15 d后统计种子的相对 萌发率 相对萌发率 处理萌发率 对照萌发率 100 以不含山梨醇的 MS固体培养基上培养的种 子为对照 CK 并观察 拍照记录山梨醇对 WT 129B08 nced3 突变体及 35S ORF WT 和 A3p ORF B08 转基因拟南芥幼苗生长发育的影响 采用 SAS 软件对数据进行统计分析 1444 作 物 学 报 第 36 卷 2 结果与分析 2 1 p35S ORF 及 pAtNCED3p ORF 双元表达 载体的构建 按图 1 和图 2 的流程构建植物双元表达载体 对构建的 p35S ORF 载体进行 PCR 和双酶切检测 结果以 ORF F 和 ORF R 为引物可特异地扩增出 1 822 bp 的 AhNCED1 基因片段 Bgl II 和 BstE II 双 酶切 p35S ORF 载体可切下相应大小的 DNA 片段 图 3 A 说明构建的 CaMV 35S 启动子驱动花生 AhNCED1 基因的植物双元表达载体成功 对构建的 pAtNCED3p ORF 载体进行 PCR 和双酶切检测 结 果以 A3p F 和 A3p R 为引物可特异地扩增出 1 452 bp 的 AtNCED3 基因启动子片段 AtNCED3p Sac I 和 Bgl II 双酶切 pAtNCED3p ORF 载体可切下相应 大小的启动子片段 图 3 B 说明已成功地构建了拟 南芥 AtNCED3 基因启动子驱动花生 AhNCED1 基因 的植物双元表达载体 图 3 双元表达载体的 PCR 及酶切检测 Fig 3 PCR and double digestion detection of binary vectors p35S ORF and pAtNCED3p ORF M DNA marker DL2000 TaKaRa A p35S ORF 表达载体的检测 1 PCR 负对照 2 PCR 检测 3 Bgl II 和 BstE II 双酶切检测 4 p35S ORF 质粒 酶切负对照 B pAtNCED3p ORF 表达载体的检测 1 PCR 负对照 2 PCR 检测 3 Sac I 和 Bgl II 双酶切检测 4 pAtNCED3p ORF 质粒 酶切负对照 M DNA marker DL2000 TaKaRa A detection of p35S ORF vector 1 negative control of PCR system 2 PCR detection 3 double di gestion by Bgl II and BstE II 4 p35S ORF plasmid as a negative control of double digestion B detection of pAtNCED3p ORF vector 1 negative control of PCR system 2 PCR detection 3 double digestion by Sac I and Bgl II 4 pAtNCED3p ORF plasmid as a negative control of double digestion 2 2 潮霉素筛选及 PCR 检测转基因拟南芥 采用花苞浸泡法 floral dipping 27 进行拟南芥 转基因 将转化后植株收取的种子播种在含 25 g mL 1潮霉素的 MS 固体培养基上 筛选转基因植株 图 4 获得 35S ORF WT 转基因拟南芥 2 个株系 图 4 A 及 A3p ORF B08 转基因突变体拟南芥 1 个 株系 图 4 B 分别对 T1代植株进行单株收种得到 T2代种子 对 T2代种子同样用含有 25 g mL 1潮霉 素的 MS 固体培养基筛选 不含有外源基因的植株 逐渐黄化死亡 而含有外源基因的植株的纯合子和 图 4 在含有 25 g mL 1潮霉素的 MS 固体培养基上筛选转基因拟南芥 Fig 4 Screening of transgenic Arabidopsis plants on MS solid media containing 25 g mL 1 hygromycin A 筛选 T1代 35S ORF WT 转基因植株 B 筛选 T1代 A3p ORF B08 转基因植株 A screening of T1 generation of 35S ORF WT transgenic plants B screening of T1 generation of A3p ORF B08 transgenic plants 第9期 万小荣等 含异位表达花生 AhNCED1 基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力 1445 杂合子均能够正常生长 将绿苗移栽 继续单株收种 得到 T3代种子 将 T3代种子继续在含有 25 g mL 1 潮霉素的 MS 培养基上筛选 不分离的为纯合株系 提取拟南芥基因组 DNA 以花生 AhNCED1 基因的特 异引物 ORF F 和 ORF R 进行 PCR 扩增 结果阳性转 化植株均扩增出 1 822 bp 的目的片段 而野生型植株 则无 PCR 扩增产物 图 5 A B 说明花生 AhNCED1 基因已整合到拟南芥基因组中 Duplex RT PCR 结果 显示 AhNCED1 基因在 35S ORF WT 和 A3p ORF B08 转基因拟南芥中均正常表达 图 5 C 图 5 转基因植株 T2代 的 DNA PCR A 和 B 和 RT PCR C 检测 Fig 5 Detection of T2 transgenic Arabidopsis plants by DNA PCR A and B and duplex RT PCR C M DNA marker DL2000 TaKaRa A DNA PCR 扩增目的基因 AhNCED1 检测 35S ORF WT 转基因拟南芥 1 以水为模板 2 以花 生基因组 DNA 为模板 3 以野生型拟南芥基因组 DNA 为模板 4 5 以转基因拟南芥基因组 DNA 为模板 B DNA PCR 扩增目的基 因 AhNCED1 检测 A3p ORF B08 转基因拟南芥 1 以水为模板 2 以花生基因组 DNA 为模板 3 以野生型拟南芥基因组 DNA 为模 板 4 以转基因拟南芥基因组 DNA 为模板 C RT PCR 检测野生型 1 35S ORF WT 2 129B08 nced3 突变体 3 和 A3p ORF B08 4 植株中 AhNCED1 基因表达 以拟南芥 18S rRNA 基因 28 为内标 M DNA marker DL2000 TaKaRa A PCR amplification of AhNCED1 gene with water 1 peanut genomic DNA 2 wild type Arabidop sis genomic DNA 3 and 35S ORF WT transgenic Arabidopsis genomic DNA 4 and 5 as templates respectively B PCR amplification of AhNCED1 gene with water 1 peanut genomic DNA 2 wild type Arabidopsis genomic DNA 3 and A3p ORF B08 transgenic Arabidop sis genomic DNA 4 as templates respectively C gene expression analysis of AhNCED1 in wild type 1 35S ORF WT 2 129B08 nced3 mutant 3 and A3p ORF B08 4 Arabidopsis plants through duplex RT PCR with Arabidopsis 18S rRNA gene as a loading control 2 3 异位表达 ectopic expression 花生 AhNCE D1 提高转基因拟南芥对外源 ABA 的敏感性 分析野生型 129B08 nced3 突变体及 35S ORF WT 和 A3p ORF B08 转基因拟南芥种子对外源 ABA 的敏感性表明 图 6 在添加 1 mol L 1 ABA 的培养基上 野生型与 35S ORF WT 转基因拟南芥 种 子 的 萌 发 均 几 乎 被 完 全 抑 制 无 明 显 差 异 129B08 nced3 突变体种子仍有较高的萌发率 说明 129B08 nced3突变体对外源ABA的敏感性降低 而 A3p ORF B08 转基因突变体种子的萌发亦几乎被 完全抑制 亦即异位表达花生 AhNCED1 提高了转 基因拟南芥对外源 ABA 的敏感性 图 6 2 4 异位表达花生 AhNCED1 提高转基因拟南芥 耐渗透胁迫能力 图 7 表明 在含不同浓度山梨醇的培养基上 129B08 nced3 突变体种子的相对萌发率均明显下降 当山梨醇浓度为 500 mmol L 1时 其绝对萌发率几 乎降为 0 而野生型和 35S ORF WT 转基因拟南芥 种子的相对萌发率分别在山梨醇浓度升高至 300 mmol L 1和 400 mmol L 1时 才明显下降 A3p ORF B08 转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型 的相当 显著高于 129B08 nced3 突变体种子的 说 1446 作 物 学 报 第 36 卷 图 6 异位表达花生 AhNCED1 提高转基因拟南芥对外源 ABA 1 mol L 1 的敏感性 Fig 6 Sensitivity increased by ectopic expression of peanut AhNCED1 to exogenous 1 mol L 1 ABA in Arabidopsis plants 明拟南芥 129B08 nced3 突变体对山梨醇有超敏性 hypersensitivity 而 AhNCED1 基因的转入提高了 转基因拟南芥 A3p ORF B08 和 35S ORF WT 的耐 渗透胁迫能力 随着山梨醇浓度的升高 所有基因 型植株幼苗均逐渐变黄 图 8 显示各基因型植株在 含 300 mmol L 1山梨醇的 MS 固体培养基上幼苗生 长情况 在 300 mmol L 1山梨醇渗透胁迫下 129B08 nced3 突变体幼苗叶片高度黄化 根的形成和幼苗 生长受到严重抑制 而 A3p ORF B08 转基因突变 图 7 山梨醇胁迫下各基因型拟南芥种子的相对萌发率 Fig 7 Relative germination rate of various genotypes of Arabidopsis under different sorbitol concentrations 标以不同小写字母者在 P 0 05 水平上差异显著 Bars superscribed by different letters are significantly different at the 0 05 probability level 体与野生型相似 叶片仅轻度黄化 大多数幼苗生 长势良好 35S ORF WT 转基因植株幼苗生长未受 明显影响 表明拟南芥 129B08 nced3 突变体对山梨 醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性 异位表达花生 AhNCED1 基因能恢复 revert 该突变体对山梨醇的 超敏性 提高转基因拟南芥的耐渗透胁迫能力 3 讨论 NCED 是高等植物 ABA 生物合成途径的限速酶 笔者克隆了花生 AhNCED1 基因 脱水胁迫明显增强 花生叶片中 AhNCED1 基因表达 1 与在玉米 8 番 茄 9 菜豆 10 豇豆 11 鳄梨 12 拟南芥 13 柑 橘 15 柱花草 17 玫红岩蔷薇 21 等植物中观察的结 果一致 AtNCED3 是调控水分胁迫下拟南芥中 ABA 生物合成的关键基因 13 24 atnced3 突变体 13 23 25 29 在水分胁迫时 植株不能累积 ABA 对水分胁迫超 敏感 本研究显示 拟南芥 129B08 nced3 突变体对 外 源 ABA 的 敏 感 性 下 降 而 异 位 表 达 花 生 AhNCED1 提高了转基因拟南芥对外源 ABA 的敏感 性 图 6 第9期 万小荣等 含异位表达花生 AhNCED1 基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力 1447 图 8 异位表达花生 AhNCED1 提高转基因拟南芥耐渗透胁迫能力 Fig 8 Ectopic expression of peanut AhNCED1 confers improved osmotic stress tolerance of transgenic Arabidopsis plants induced by 300 mmol L 1 sorbitol 烟草和番茄中异位表达番茄LeNCED1基因 均提 高了转基因植物的内源 ABA 水平 30 拟南芥中异位表 达水稻 OsNCED3 基因 25 拟南芥中过表达 over ex pression AtNCED3 基因 31 烟草中过表达 菜豆 PvNCED1 基因 31 烟草中过表达柱花草 SgNCED1 基 因 32 33 均提高了转基因植物的内源 ABA 水平和水分 胁迫抗性 本研究表明 在山梨醇胁迫下 129B08 nced3 突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的 而 A3p ORF B08 转基因拟南芥种子的相对萌发率 与野生型的相当 显著高于129B08 nced3突变体的 且 300 mmol L 1山梨醇渗透胁迫下 35S ORF WT转 基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的 图 7 在 300 mmol L 1山梨醇胁迫下 129B08 nced3 突变体幼苗叶片高度黄化 根的形成和幼苗生长受 到严重抑制 而 A3p ORF B08 转基因突变体与野 生型相似 叶片仅轻度黄化 幼苗生长势良好 图8 35S ORF WT 转基因植株幼苗生长未受明显影响 在 400 mmol L 1山梨醇渗透胁迫下 其萌发 图 7 生 长开始受明显抑制 幼苗叶片明显黄化 资料未给 出 这些结果说明 拟南芥 129B08 nced3 突变体对 山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性 花生 AhNCED1 基因转入能恢复该突变体对山梨醇的超 敏性 提高转基因拟南芥的耐渗透胁迫能力 与 Iuchi 等 13 和 Ruggiero 等 29 研究过表达 AtNCED3 基 因互补 complement 拟南芥 atnced3 突变体对脱水胁 迫的超敏性 Hwang 等 25 研究异位表达 OsNCED3 基因互补 129B08 nced3突变体对干旱胁迫的超敏性 等实验结果相一致 这些研究对于了解农作物响应 干旱胁迫的分子机制 通过植物基因工程提高农作 物抗旱性及农作物抗旱育种具有重要的理论意义和 深远的应用前景 4 结论 成功构建了 CaMV 35S启动子和拟南芥 AtNCE D3 基因启动子 AtNCED3p 驱动花生 AhNCED1 基 因的两个植物双元表达载体 p35S ORF 和 pAtNCE D3p ORF 分别转化野生型和 129B08 nced3 突变体 拟南芥 获得 35S ORF WT 和 A3p ORF B08 转基 因植株 转基因拟南芥对外源 ABA 的敏感性提高 拟南芥 129B08 nced3突变体对山梨醇诱导的非离子 渗透胁迫有超敏性 转基因能恢复该突变体对山梨 醇的超敏性 提高拟南芥的耐渗透胁迫能力 References 1 Wan X R Li L Molecular cloning and characterization of a de hydration inducible cDNA encoding a putative 9 cis epoxy carotenoid dioxygenase in Arachis hypogaea L DNA Seq 2005 16 217 223 2 Yan M L 严美玲 Li X D 李向东 Jiao Y L 矫岩林 Wang L L 王丽丽 Identification of drought resistance in different peanut varieties J Peanut Sci 花生学报 2004 33 1 8 12 in Chinese with English abstract 3 Zeevaart J A D Abscisic acid metabolism and its regulation In Hooykaas P J J Hall M A Libbenga K R eds Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones Amsterdam Elsevier Science 1999 pp 189 207 4 Nambara E Marion Poll A Abscisic acid biosynthesis and catabolism Annu Rev Plant Biol 2005 56 165 185 5 Taylor I B Sonneveld T Bugg T D H Thompson A J Regulation and manipulation of the biosynthesis of abscisic acid including the supply of xanthophyll precursors J Plant Growth Regul 2005 24 253 273 6 Kende H Zeevaart J A D The five classical plant 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biosynthesis under water stress in drought tolerant cowpea Plant Physiol 2000 123 553 562 12 Chernys J T Zeevaart J A D Characterization of the 9 cis ep oxycarotenoid dioxygenase gene family and the regulation of abscisic acid biosynthesis in avocado Plant Physiol 2000 124 343 353 13 Iuchi S Kobayashi M Taji T Naramoto M Seki M Kato T Ta bata S Kakubari Y Yamaguchi Shinozaki K Shinozaki K Regulation of drought tolerance by gene manipulation of 9 cis epoxycarotenoid dioxygenase a key enzyme in abscisic acid biosynthesis in Arabidopsis Plant J 2001 27 325 333 14 Soar C J Speirs J Maffei S M Loveys B R Gradients in stomatal conductance xylem sap ABA and bulk leaf ABA along canes of Vitis vinifera cv Shiraz biochemical and molecular bio logical evidence indicating their source Funct Plant Biol 2004 31 659 669 15 Rodrigo M J Alquezar B Zacarias L Cloning and characteriza tion of two 9 cis epoxycarotenoid dioxygenase genes differen tially regulated during fruit maturation and under stress 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