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望尔生物技术 引领科技进步 WE-CP-A091北 京 望 尔 生 物 技 术 有 限 公 司磺胺“三合一”ELISA检测试剂盒说明书地址：北京市昌平区回龙观国际信息产业基地高新四街8号 邮编：102206 电话：总机 01080700520/21/22/23/24 销售：214/226/220 技术支持：213/307 网址：http:/www. W Email：一、概要磺胺类药物（SAs）是应用广泛的抗菌素，对畜禽疾病控制和治疗起到重要作用。但由于磺胺类药物存在严重副作用，人体中长期存在磺胺类药物会导致许多细菌对磺胺类药物产生耐药性，且有潜在的致癌性。我国农业部第235号文件规定其残留限量为100mg/kg,由于高效液相色谱等仪器分析方法样本前处理及测定操作繁琐和费用高，推广使用受到限制。本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，与仪器分析技术相比具有快速、简便、准确和灵敏度高等特点，操作时间仅需1.5小时，能最大限度地减少工作强度和操作误差。2005年10月，按农业部关于加强兽药残留检测试剂（盒）管理的通知（农办医20053号）的要求，该试剂盒在农业部实行了备案（中华人民共和国农业部公告第558号文件）。二、试验原理本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDM）与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗三者的抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含磺胺类药物的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中磺胺类药物的残留量。三、适用范围可定性、定量检测动物组织（肌肉/肝脏/鱼/虾）、鸡蛋、蜂蜜、牛奶、血清等样品中磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDM）药物的残留量。四、交叉反应率磺胺二甲基嘧啶（SM2） 100%磺胺间二甲氧嘧啶（SDM） 23%磺胺甲基嘧啶 （SM1） 12%五、使用单位需自备的设备及试剂 设备：微孔板酶标仪450nm/630nm旋转蒸发仪/氮气吹干装置均质器振荡器涡旋仪离心机天平：感量0.01g刻度移液管：10ml洗耳球 容量瓶：1L玻璃试管：10ml聚苯乙烯离心管：1.5 ml 、50ml 微量移液器：单道 20ml200ml、100ml1000ml多道 250ml 试剂：-乙腈(分析纯)（动物组织专用）-乙酸乙酯(分析纯)-正己烷(分析纯)-十二水合磷酸氢二钠(分析纯)-二水合磷酸二氢钾(分析纯)-氯化钠(分析纯)-氯化钾(分析纯)-去离子水六、提供的材料与试剂1、96孔酶标板1块 （包被有偶联抗原）2、标准液6瓶：（1ml/瓶）0ppb，1ppb，3ppb，9ppb，27ppb，81ppb 3、高浓度标准品：（1ml/瓶） 1ppm4、酶标二抗 7ml 红色帽5、抗体工作液 10ml 绿色帽6、底物液 A 液 7ml 白色帽7、底物液 B 液 7ml 红色帽8、终 止 液 7ml 黄色帽9、20浓缩洗涤液 40ml 透明帽10、20浓缩提取液 50ml 蓝色帽七、溶液的配制 配液1: 0.02M PBS1缓冲液 称取5.36g十二水合磷酸氢二钠、0.20g二水合磷酸二氢钾、8.00g氯化钠和0.20g氯化钾加去离子水溶解定容至1L配液2: 提取工作液 用去离子水将20浓缩提取液按1：19体积比进行稀释（1份20浓缩提取液+19份去离子水）用于样本的提取，提取工作液在4环境可保存一个月。配液3: 洗涤工作液用去离子水将20浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（或按需量稀释）（1份20浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4环境可保存一个月。八、样本前处理步骤样本处理前须知处理任何样本时，都必须注意：（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。 （b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。 （c）低检测限组织样本检测方法处理的样本，使用复溶工作液复溶样本后须立即用于分析，不能保存。（d）其他前处理方法处理后的样本均可于4保存24小时。（一）高检测限样本前处理方法(a) 动物组织(鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、鸡蛋)用均质器均质样本（鸡蛋样本用均质器低速均质鸡蛋样本，使得蛋清和蛋黄充分混合）；称取2.00.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入8ml乙腈，立即用振荡器振荡20min，3000g以上离心5min；取上清液2.5ml至10ml干净的玻璃试管中，于5060水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动20s溶解干燥残留物，再加入1ml 0.02 M PBS1缓冲液（见配液1），用涡旋仪涡动1min，3000g以上离心10min；除去上层正己烷相，取下层水相20l用于分析。(b) 动物组织（鱼、虾）用均质器均质组织样本；称取2.00.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入2ml去离子水，用涡旋仪涡动至糊状，用10ml移液管加入8ml乙腈，立即用振荡器振荡20min，3000g以上，离心5min；取上清液2.5ml至10ml干净的玻璃试管中，于5060水浴氮气流下吹干；加1ml正己烷至50ml聚苯乙烯离心管中，用涡旋仪涡动20s溶解干燥残留物，加入1ml 0.02M PBS1缓冲液（见配液1），用涡旋仪涡动1min，3000g以上离心10min；除去上层正己烷相，取下层水相20l用于分析。（二）低检测限样本提取方法（a）动物组织（低脂肪的肌肉、肝脏等）用均质器均质组织样本；称取2.00.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml提取工作液（见配液2），用振荡器充分上下混合振荡10min，再放入37恒温箱，30min后取出，3000g以上，10离心10min；-取清亮上清20ml用于分析。(b)动物组织（高脂肪的肌肉或肝脏等）用均质器均质组织样本；称取2.00.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml提取工作液（见配液2），再加入5ml正己烷，用振荡器充分上下混合振荡10min，3000g以上，10离心15min；去上层正己烷，取下层100ml至1.5ml聚苯乙烯离心管中，加入0.02 M PBS1缓冲液（见配液1）100ml混合；取20ml用于分析。（三）血清样本前处理方法-将血清样本于室温放置30min，3000g以上，10离心10min，分离出血清或过滤血清；-取1ml血清至10ml干净的玻璃试管中，加入3ml 0.02 M PBS1溶液（见配液1）混合均匀；-取20ml用于分析。（四）蜂蜜前处理方法-称取1.00.05g蜂蜜样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入2ml 0.02 M PBS1缓冲液（见配液1）溶解；-加入8ml乙酸乙酯，用振荡器振荡10min，3000g以上，离心10min；-取上层液体4ml至10ml干净的玻璃试管中，于5060水浴氮气流下吹干，加0.5ml 0.02 M PBS1缓冲液（见配液1）溶解干燥的残留物；-取20ml用于分析。（五）尿液前处理方法将尿液于3000g以上，室温（20-25）离心5min，直至尿液样本清亮；移取1ml清亮尿液至10ml干净的玻璃试管中，加入3ml提取工作液混合；取20ml用于分析。（六）牛奶前处理方法取牛奶样本，3000g以上，10离心10min，吸除上层脂肪；-取1ml离心后的牛奶样本，用0.02 M PBS1缓冲液（见配液1）按119的体积比进行稀释（即20ml牛奶+380ml 0.02 PBS1缓冲液）；-取20ml用于分析。九、检测步骤测定前应须知：1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25）。2、使用之后立即将所有试剂放回2-8。3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。操作步骤：1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml 到对应的微孔中，随即加入酶标二抗50ml/孔，再加入抗体工作液80ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25避光环境中反应60min。6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见配液3）250ml/孔，充分洗涤45次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。7、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25避光环境中反应30min（见注意事项8）。8、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。十、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含磺胺类药物的含量成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.111，样本2的吸光度值为0.585，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.428；1ppb为1.047；3ppb为0.645；9ppb为0.337；27ppb为0.161；81ppb为0.063。则样本1的浓度范围是27ppb-81ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中磺胺类药物残留的浓度范围；样本2的浓度范围是3ppb-9ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中磺胺类药物残留的浓度范围。2、定量分析（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）B100%B0B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B00ppb标准溶液的平均吸光度值（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以磺胺类药物标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中磺胺类药物的实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）样本稀释倍数（一）高检测限样本：（a）方法处理肌肉/肝脏和鸡蛋样品稀释倍数：2（b）方法处理鱼、虾样品稀释倍数：2（二）低检测限样本（a）低脂肪肌肉/肝脏： 5（b）高脂肪肌肉/肝脏： 10（三）血清样品稀释倍数：4（四）蜂蜜样品稀释倍数：1（五）尿样样品稀释倍数：4 （六）牛奶样品稀释倍数：20 十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度试剂盒灵敏度：1ppb样本最低检测限：蜂蜜1ppb血清/尿样4ppb牛奶20ppb组织样本检测下限高检测限肌肉/肝脏和鸡蛋2ppb鱼、虾2ppb低检测限肌肉/肝脏5ppb 高脂肪肌肉/肝脏 10ppb准确度：鸡肉/肝、猪肉/肝7510%鸡蛋6910%蜂蜜、牛奶、血清7010%精密度：试剂盒的变异系数均小于10%十二、注意事项1、室温低于20或试剂及样本没有回到室温（20-25）会导致所有标准的OD值偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需要将其摇匀。4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。6、储存条件保存试剂盒于2-8，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和