AKTA 简要操作说明.doc

AKTApurifier简要操作说明 打开仪器的主电源，打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。 Unicorn Manager文件管理、Method Edit方法编辑、System Control系统控制、Evalution结果处理，4个窗口同时打开，同时关闭。 Unicorn Manager中Manual运行的结果自动保存在Manualruns的文件夹中，文件名从Manualrun1Manualrun10，第11个结果会覆盖第1个文件（最多保存10个默认的文件名）。如果手动结果需要长期保存，可以remove到指定文件夹或者rename。可以利用Manual-other-record-on（off）来选择文件夹，制定文件名保存手动结果。 手动命令(Manual)见KTA系统手动命令指南 利用脱盐实验熟悉手动操作(System ControlManual) 脱盐试验原理：凝胶过滤 (或称分子筛) 层析是一种由限制分子通过多孔基质，按分子大小分离混合分子的技术 。蛋白质是生物大分子，分子量比盐等小分子大许多倍，用凝胶过滤方法为生物产品脱盐十分简单、可靠 。由于层析方法可透过紫外和电导检测器监控整个层析脱盐的过程。Sephadex G-25 介质用带3- 氯-1 ，2- 环氧丙烷(epichlorohydrin) 交联葡聚糖加工成珠状的介质。适合分子量在5000 以下的生物分子的脱盐及缓冲液置换工作。在该实验中，蛋白质是大分子，盐离子是小分子，因此蛋白质先出来（280nm有特征吸收），盐离子后出来（电导值显示） o 样品：5mg/mLBSA，0.5M NaCl溶液 10mL o binding buffer缓冲液：去离子水 o 层析柱：HiTrap Desalting 5 mL o 流速：5mL/min, o 样品体积：200ul/0.5mL/1mL。 操作： 1）准备工作溶液和样品 所有的工作溶液和样品必须经过0.45µm的滤膜过滤，使用前用低频超声脱气10min。 2）清洗及管道准备 首先将A1管道放入binding buffer中，在System Control窗口点击工具栏内的Manual，选择 PumpPump wash purifier，选中A1管道为ON， Execute。泵清洗将自动结束。 3）安装层析柱： 在Manual里选择PumpFlow rate，输入流速5mL/mL，Execute，读取系统空压X Mpa（没有安装层析柱的系统压力），选择Alarm&monalarm pressure，设置high alarm,输入X+0.3Mpa（填料的耐受压力，可在填料说明书中查到），Execute。Flow rate，输入流速1mL/mL，Execute，待InjectionValve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。改变Flow rate，输入流速5mL/mL，Execute 4)开始纯化： o 选择检测波长，Alarm&monWavelengthUV1,UV2,UV3(可以只打开一个波长280nm)等待柱子平衡好了（观察电导COND，pH的数值和变化趋势）就准备上样了。此时将紫外调零，选择Alarm&monautozero，Execute。 o 用样品环上(也可在平衡时将样品推入样品环)：将样品吸进注射器，推掉气泡，从InjectionValve的3号位推入，推好后不要取下注射器。在Manual里选择FlowpathInjectionValveInject，Execute。 o 设定收集： 固定体积收集：（如果有出口阀）ManualFlowpathoutletvalveF2，insert，选择FracMan_fractionation，输入每管收集体积，insert，exectue。结束固定体积收集选择Fracfractionation_stop，exectue。 峰收集：选择FracPeak_fracParametersUV_Level,设定峰收集的参数，insert，选择FracPeak_Man_fractionation设定峰收集每管收集的体积，insert，Execute。结束峰收集选择FracPeak_frac_stop，Execute。 5）清洗泵及卸下层析柱： 将A1入口放入纯水中，启动Pump wash purifier功能冲洗A泵和B泵及整个管路。设定Flowrate，alarm pressure，清洗柱子和管路，直至cond0.1ms/cm，UV几乎不变；然后再将A1和B1入口放入20乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存。系统给柱子一个慢流速，设置系统保护压力，然后先拆柱子的下端，正在滴水的时候将堵头拧上，再拆柱子的上端，最后拧上上端的堵头。整个过程防止气泡进入。 6）关闭电源： 从软件控制系统的第一个窗口unicorn manager点击退出，其他窗口不能单独关闭。然后关闭KTA主机电源，关闭电脑电源。 结果处理Evaluation 1）图形或数据拷贝、导出 在Unicorn软件Evaluation界面Open结果文件 图形拷贝：空白处右键copy to clipboard open wordpaste得到结果的图形 在Evaluation界面，FileExportCurves 选中206nm Select Export Excel filesOK 2）积分工具和柱效测定 在Unicorn软件Evaluation界面打开结果文件夹。 积分：Integrate Peak integrate 选择待积分曲线，如：UV1_280nm Peak window(调整积分区域，使其包含主峰) Reject Peaks (Peaks must be one of 1or 几个 largest) Baseline(选择Correlated baseline) Column height：输入实际柱高，如 90cm OK Chromatogram LayoutPeak Table Plate height(HETP) Asymmrtey OK 可得到柱效（HETP），对称性（As） Tip：如果峰之间没有达到基线分离，则Baseline选择Calculate baseline计算的基线Baseline settings Morphological形态学Structure width（mL，在多少mL中选取比较平滑的线作为基线，该数值设置大一些） 新建柱子 具体软件操作如下： 在Unicorn软件Method Editor界面中选择Edit Column List 新建一根自己的柱子：New New Column中输入柱参数：输入Height，柱子直径diameter；输入其他相关参数：Vt，Vo，Max Pressure，Default Flowrate，Max Flowrate等，然后Save As特定的柱名。 这样在Column List中 就有了我们自己编辑好的层析柱。 新建方法： 在Unicorn软件Method Editor界面中选择FileNewWizardOK Main Selection层析方式选择：Affinity、Anion/Cation Exchange、HIC、Size exclusion Column：Any（或者预装柱）Flexible Flow Rate在不同阶段用不同流速Next Wavelength 波长选择UV：280nm Pump Inlet入口选择Next Equalibration： Start Concentration %B起始浓度选择Equalibration Volunme： CV平衡体积Watch Equlibration和前一个条件是满足任一条件，就跳入下一步。 Sample Injection：Injection Technique: Manual注射器上样 Empty Loop With：1mL； 或者 System Pump Direct Loading系统泵直接上样Injection Volume 上样体积（必须10mL），默认样品入口为A2(如果HIC，默认B2) Next Wash Out Unbound Sample清洗未结合蛋白，默认2CV（最后参数表可以修改）Flowthrough Fractionation穿透峰收集（Frac-900、OFF、Outlet F3出口阀F3收集）Next Elution Fractionation洗脱收集Frac-900收集器收集、OFF、Outlet出口阀收集Fixed Volume Fractionation固定体积收集、Peak Fractionation峰收集、Fixed Volume and Peak Fractionation固定体积和峰收集相结合Fraction Volume固定体积收集每管体积Next Peak Fractionation设定峰收集Peak Identification UV Level峰高度、UV Slope紫外斜率Minimum Peak Width最小峰宽（排除气泡峰）Peak Fractionation VolumeNext Elution洗脱模式(根据工艺选择一种设定) Isocratic等度洗脱（凝胶过滤）Length of Elution 洗脱体积Finish Isocratic with Delayed Frationation延迟峰收集的等度洗脱Length of Elution before Fractionation 从0.2CV开始采进行峰收集Length of Elution with Fractionation Finish Linear Gradient 线性洗脱Target Concentration目标变化浓度Gradient Length梯度长度（一般1020CV）Use cond or concB to start and stop Fractionation利用电导或B%开始或者停止收集Clean after Elution at 100B%(5CV)清洗Reequilibration after Elution(5CV)再平衡Finish Segmented Gradient Advanced高级梯度 Gradient Segments最多可以设定9个步骤 Elution Segment1(1)-Page1(2) Step阶段梯度Gradient线性Pump Inlet A入口Concentration B浓度Length of Step 梯度长度 Fraction V