酪氨酸激酶受体B论文：活性羧肽酶E海马神经元膜表面水平.doc

酪氨酸激酶受体B论文：活性羧肽酶E海马神经元膜表面水平【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。【摘要】一.研究背景神经元突触可塑性不仅在发育期对神经环路的建立起重要作用,而且在成年期参与控制脑的认知功能和复杂行为。脑源性神经营养因子(BDNF)不仅能促进神经元的存活、分化以及树突、轴突的生长,而且在调节突触的可塑性方面也起到关键作用。大量研究已表明BDNF对神经元突触的调控,受神经元活性的调节,BDNF优先作用于有活性的神经元或突触。BDNF的功能受体主要有两类：p75神经营养素受体和TrkB酪氨酸激酶受体,其中,TrkB是其的高亲和力受体,而且是介导BDNF功能发挥的关键分子。因此,神经元表面TrkB受体的水平对于BDNF功能的发挥具有重要作用。大量研究显示活性刺激能促进神经元膜表面TrkB受体水平的显著升高,例如高K+刺激,高频电刺激及Glycine(化学性LTP诱导剂)作用等。这在一定程度上解释了BDNF对神经元的作用受神经元活性的调节,因为高活性的神经元膜表面的TrkB受体含量较高,更容易接受来自BDNF的信号。但神经元活性促进膜表面TrkB受体含量增加的分子细胞学机制尚不十分清楚。TrkB受体的胞内域是调控其运输的关键区域,于是用TrkB受体胞内域为诱饵进行酵母双杂交,钓取有可能与TrkB结合并调控其活性依赖性胞内转运的分子CPE。CPE分子存在两种形式：游离型和膜结合型。游离型CPE主要发挥羧肽酶的功能；而膜结合型CPE是一种既可以参与调节性分选,介导POMC,胰岛素等进入调节性运输途径,也可以作为中间分子介导调节性囊泡的运输等的多功能分子。那么,CPE与TrkB的这种结合,是否对TrkB受体的活性依赖的调节性胞内运输过程有功能意义呢?二.研究目的本研究旨在证实CPE能调控TrkB受体神经元活性依赖的胞内转运,从而有助于我们进一步探究神经元活性促进TrkB受体膜表面水平升高的机制,并由此为临床BDNF所介导的精神疾病及学习记忆功能等提供参考。三.研究方法1.免疫共沉淀实验。免疫共沉淀技术,是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。在293细胞中过表达相应的各种CPE或TrkB的突变体。裂解细胞收集上清,根据特异识别不同分子的相应抗体偶联的琼脂糖珠子进行免疫沉淀,那么与之结合的分子也会共沉淀下来,之后用Western blot技术进行检测。通过此方法可以确定CPE与TrkB的结合及具体结合区域。2.免疫荧光实验。免疫荧光即根据抗原抗体反应的特异性用荧光抗体示踪或检查相应抗原。我们利用该技术对外源过表达的CPE与TrkB在海马神经元的定位情况进行荧光标记,并通过激光共聚焦显微镜进行观察记录。利用该技术,检测干扰CPE的表达后,Glycine活性刺激对TrkB在树突棘及对应树突干的相对分布是否有影响。免疫荧光实验,检测干扰CPE表达对BDNF-TrkB所介导的树突棘生长及形态可塑性的影响。3.全内反射荧光(TIRF)显微镜技术。TIRF显微镜技术广泛应用于细胞表面附近分子的动态观察。在海马神经元中共转染CPE-RFP和TrkB-GFP两种质粒。在活细胞状态下,分别在Glycine刺激前后,观察拍照,记录CPE-RFP和TrkB-GFP的在膜表面附近的共定位的点的运动情况。4. Western Blot实验。Western Blot是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。本研究中用于检测一系列免疫共沉淀结果,膜表面生物素结果及CPE对活性条件下的BDNF-TrkB介导的下游信号通路功能的影响的结果。5.膜表面生物素标记实验。用生物素标记细胞膜表面的蛋白,收集细胞裂解液,然后用与生物素有高亲和力的亲和素分离膜表面蛋白,最后用Western blot技术及相应的抗体进行检测。在海马神经元中干扰内源CPE的表达,研究CPE对神经元中内源TrkB活性依赖的上膜的影响。6.免疫荧光染色定量分析法。将TrkB及其突变体的N端融合Flag标签,C端融合GFP绿色荧光蛋白。参照赵玲老师已发表的文章中已建立的膜表面荧光定量分析法,在神经元中转染这些质粒,然后进行免疫细胞化学实验,在非透化情况下,用594荧光素标记Flag,代表的是膜表面的TrkB或其突变体结构；GFP绿色荧光显示的是总的TrkB或其突变体结构,再将红绿荧光比值通过已知的比率换算,即可得出膜表面TrkB或其突变体的分布比例情况。如果同时共转CPEsiRNA或CPE DN质粒等,即可检测它们对TrkB受体的活性上膜过程的影响。四.研究结果前期山东大学神经生物研究所赵玲老师的研究结果中已通过免疫共沉淀及免疫荧光实验证实了CPE与TrkB受体的结合与在海马神经元中的共定位；同时,通过干扰的CPE表达,利用膜表面免疫荧光定量分析法,证实CPE分子确实能影响TrkB受体神经元活性依赖的上膜。这里我们又通过另外的实验对这一结果进行了丰富并进一步开展了相关机制和功能实验,如下：1.CPE调节内源性TrkB受体活性依赖的上膜。前面已知,CPE能影响海马神经元中外源过表达Flag-TrkB的活性依赖的上膜。这里,我们通过膜表面生物素化的方法,研究CPE对海马神经元中内源TrkB受体的活性依赖的上膜的调控。通过膜表面蛋白分子的生物素标记,亲和素对生物素结合蛋白的分离,在Western Blot的蛋白检测结果中,我们得出,活性刺激能促进内源TrkB的上膜,但当干扰CPE的表达后,这种作用消失。因此,CPE在生理水平上,对内源性TrkB受体活性依赖的上膜也有调节作用,进一步证实了CPE对TrkB受体活性依赖的上膜的重要性。2.CPE与TrkB活性依赖的膜表面附近的共运动。海马神经元中共转染CPE-RFP和TrkB-GFP两种质粒,分别在Glycine刺激前后,观察拍照,记录CPE-RFP和TrkB-GFP囊泡由活性刺激引起的在膜附近的运动情况。通过结果,我们发现,Glycine刺激能促进膜表面附近CPE-RFP与TrkB-GFP共定位点的增多。因此,这个结果说明,Glycine活性刺激不仅能促进TrkB向膜表面附近的运动,也能促进CPE向近膜的分布,表明CPE可能在TrkB向膜表面附近运动过程中发挥作用。3.CPE促进活性依赖的TrkB从树突干向对应树突棘的转运。树突棘是形成兴奋性突触的关键部位,因此TrkB向树突棘的分布能一定程度的反映CPE能促进TrkB活性依赖的功能发挥。通过在海马神经元中转染CPE siRNA,降低CPE的表达,再进行免疫荧光染色。通过统计分析,我们得出,在对照组,加入Glycine后能显著促进TrkB的膜表面分布,但干扰CPE表达组抑制了这种增加。因此,此结果证明,CPE有助于Glycine刺激所引起的TrkB从树突干向树突棘的运动。4. TrkB受体近膜(JM)区的BOX2域是介导它与CPE结合的关键区域。首先我们构建了缺失TrkB胞内域不同区域的缺失突变体,然后通过一系列免疫共沉淀和Western Blot的方法检测它们的结合情况,想通过区域缺失的方法来逐步明确介导它们之间结合的关键区域。我们分别构建了缺失胞外域的CPE (CPEC25)和TrkB (TrkBEX),以及在此基础上又进一步的分别缺失TrkB胞内域的JM区、TK区和CT区。通过实验结果,我们确定JM区是介导它与CPEC25结合的关键区域。进一步为了细化JM区的具体哪个区域介导它与CPEC25的结合,我们又构建了缺失JM区不同“BOX”域(EXTrkBBO1/2/3)的突变体。通过实验结果,我们知道JM区的BOX2域是介导它与CPEC25结合的关键区域。5. TrkB的JM区BOX2域对于TrkB受体的活性依赖性上膜过程是充分必要的。根据TrkB受体膜表面免疫荧光定量分析法,在海马神经元中分别过表达缺失JM区不同BOX域的Flag-TrkBBOX1/2/3-GFP突变体,然后进行免疫荧光染色。通过结果统计,我们可以看出JM区的BOX2域是TrkB受体的活性上膜过程的必需结构。同样根据TrkB受体膜表面免疫荧光定量分析法,在海马神经元中分别过表达嫁接不同BOX域的Flag-T1+BOX1/2/3-GFP突变体,然后进行免疫荧光染色。通过结果统计,我们可以得出JM区的BOX2域能赋予T1活性依赖的上膜功能,因此JM区的BOX2域对于TrkB受体的活性上膜过程是充分的。6.CPE的第462-466个氨基酸是介导它与TrkB结合的关键区域。首先我们构建了缺失CPEC25C末端不同区域的突变体(CPEC254, CPEC256, CPEC2510, CPEC2515),同样通过免疫共沉淀和WesternBlot的方法检测它们与的TrkBEX结合情况。通过本实验,我们确定了CPE的第462-466个aa是介导CPEC25与TrkBEX结合的关键区域。7.CPE调控活性条件下BDNF-TrkB介导的下游信号。既然我们推测,CPE能影响神经元活性依赖的TrkB膜表面水平,接下来我们想检测CPE对BDNF所介导的下游信号通路功能影响。收取转染了CPEsiRNA或ctr siRNA的海马神经元蛋白裂解液,通过Western Blot实验,然后分别用对应的抗体检测。通过检测磷酸化水平的TrkB,下游的Erk1/2和AKT信号分子,我们发现Glycine刺激能够明显的促进TrkB及其信号通路下游分子的活性水平增加,但干扰了CPE表达后,这种现象受到抑制。此结果表明,CPE确实能影响活性刺激引起的BDNF下游的信号功能,进一步证明CPE能影响TrkB活性依赖的膜表面分布。8.CPE调控活性条件下BDNF-TrkB所介导的树突棘生长及可塑性。研究已表明,BDNF-TrkB信号通路能够影响树突棘的生长、分支及动态变化。我们因此想验证,CPE对于BDNF-TrkB所介导的另一功能,来进一步证明,CPE能够影响TrkB活性依赖的神经元膜表面分布。转染了Ctr siRNA或CPE siRNA的海马神经元,分别经BDNF单独处理10min或经Glycine (10min)+BDNF(10min)处理,然后检测树突棘形态的变化。在过表达CtrsiRNA组,Glycine+BDNF组较单独加BDNF作用组,能更加促进树突棘的密度增加,及树突棘大小的增加,但干扰了CPE的表达后,明显的抑制了这种现象。因此说明,CPE能够影响活性刺激引起树突棘的生长,也同时进一步证明CPE在影响TrkB活性依赖的膜表面分布过程中发挥重要作用。五.结论CPE分子确实能够通过影响海马神经元活性介导的TrkB受体的胞内运输,最终影响TrkB受体的活性依赖的上膜。TrkB胞内近膜区的BOX2区域是介导它与CPE胞内域结合的关键区域；CPE的第462-466个aa区域是介导它与TrkBEX结合的关键区域。CPE分子在调控TrkB受体活性依赖的胞内转运并进而影响TrkB的活性引起的膜表面表达水平的同时,对于BDNF在活性条件下所介导