溶血链球菌检测.doc

溶血链球菌检测1 设备和材料1.1 冰箱：04。1.2 恒温培养箱：361。1.3 恒温水浴锅：361。1.4 显微镜：10100。1.5 均质器或灭菌乳钵。1.6 离心机：4000 r/min。1.7 架盘药物天平：0g500g，精确至0.5g。1.8 灭菌试管：10mm100mm、16mm160mm。1.9 灭菌吸管：1rnl(具0.01ml刻度)、5ml、l0ml(具0.1ml刻度)。1. 10 灭菌锥形瓶：100ml。1. 11 灭菌培养皿：直径90mm。1. 12 灭菌棉签、镊子等。2 培养基和试剂2.1 葡萄糖肉浸液肉汤和肉浸液肉汤：见附录中1。在肉浸液肉汤内加入1%葡萄糖即为葡萄糖肉浸液肉汤。2.2 匹克氏肉汤；见附录中2。2.3 血琼脂平板：见附录中3。2.4 人血浆。2.5 0.25%氯化钙。2.6 0. 85%灭菌生理盐水：见附录4。2.7 杆菌肽药敏纸片（含0. 04单位）。3 操作步骤3.1 样品处理 按无菌操作称取食品检样25g(rnl)，加入225ml灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。3.2 培养 将上述混悬液吸取5ml，接种于50ml葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线接种于血平板。如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36l培养24 h，接种血平板，置361培养24 h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。3.3 形态与染色 本菌呈球形或卵圆形，直径0.5mlm，链状排列，链长短不一，短者4个8个细胞组成，长者20个30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。3.4 培养特性 该菌营养要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长对管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色，半透明或不透明，表面光滑，有乳光，直径约0.5mrn0. 75mm，为圆形突起的细小菌落，乙型溶血链球菌周围有2mm4mm界限分明、无色透明的溶血圈。3.5 链激酶试验 致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶（即溶纤维蛋白酶），此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原，使成血浆蛋白酶，而后溶解纤维蛋白。 吸取草酸钾血浆0.2ml，加0.8ml灭菌生理盐水，混匀，再加入18h24h、36土1培养的链球菌培养物0.5ml及0.25%氯化钙0.25ml（如氯化钙已潮解，可适当加大至0.3%0.35%），振荡摇匀，置于361水浴中10min，血浆混合物自行凝固（凝固程度至试管倒置，内容物不流动），然后观察凝固块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24 h后不溶解即为阴性。草酸钾人血浆配制：草酸钾0.01g放人灭菌小试管中，再加入5ml人血，混匀，经离心沉淀，吸取上清液即为草酸钾人血浆。3.6 杆菌肽敏感试验 挑取乙型溶血性链球菌液，涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04单位的杆菌肽纸片，放于上述平板上，于361培养18 h24 h，如有抑菌带出现即为阳性，同时用已知阳性菌株作为对照。附录 培养基和试剂1 葡萄糖肉浸液肉汤1.1 成分绞碎牛肉500g氯化钠5g蛋白胨10g磷酸氢二钾2g葡萄糖10g蒸馏水1000ml1.2 制法将绞碎之去筋膜无油脂牛肉500g加蒸馏水1000ml，混合后放冰箱过夜，除去页面之浮油，隔水煮沸半小时，使肉渣完全凝结成块，用绒布过滤，并挤压收集全部滤液，加水补足原量。加入蛋白胨，氯化钠、磷酸盐和葡萄糖，溶解后调节pH，煮沸并过滤，分装，121高压灭菌30min。2 匹克氏肉汤2.1 成分含1%胰蛋白胨的牛心浸液200ml1:25000结晶紫盐水溶液10ml1:800叠氮化钠溶液10ml脱纤维兔血（或羊血）10ml2.2 制法将上述已灭菌的各种成分，用无菌手续依次混合，分装于无菌试管内，每管内越2ml，保存于冰箱内备用。3 血琼脂3.1 成分蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15g20g蒸馏水1000mlpH 7.27.43.2 制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2ml校正pH，加入琼脂，加热煮沸，使