000001b4_王丽楠-应用药理.doc

传统发汗方法对杜仲降压作用的影响王丽楠，杨美华*（中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京100193）摘要 目的：考察传统发汗方法对杜仲降压作用的影响。方法 采用高效液相色谱法，以杜仲发汗前后对血管紧张素转化酶抑制率变化为指标，流动相为乙腈-水，检测波长228 nm。结果 仅从血管紧张素转化酶抑制率实验考察，杜仲发汗前抑制率低于发汗后抑制率。结论 该方法为研究传统发汗对杜仲降压作用的影响提供数据参考。关键词：高效液相色谱法；杜仲；血管紧张素转化酶抑制率；ACEThe effect of traditional processing method on the hypotensive effect of Eucommiae ulmoidesWang Li-nan, Yang Mei-hua(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College, BeiJing 100193, China;)ABSTRACT: OBJECTIVE Study on the the effect of traditional processing method on the hypotensive effect of Eucommiae ulmoides. METHODS The sample was determined by HPLC with the mobile phase consisting acetonitrile (A)-water (B). The detection wavelength was at 228nm. RESULTS Considering the ACE inhibition ratio, the result of Eucommiae ulmoides before processing is better than the result of Eucommiae ulmoides after processing. CONCLUS ION This experiment is offer essential data reference and basis for the research on the traditional processing method.KEY WORDS:HPLC, Eucommiae ulmoides, ACE inhibition ratio, ACE杜仲Eucommiae ulmoides为杜仲科杜仲属植物，为我国传统名贵中药材，具有补中益气、坚筋骨、强志、安胎、久服轻身耐劳之功效。杜仲主要分布于滇、黔、川、桂、豫、甘、陕及长江中下游等省，被列为国家二级保护植物。早在二千年前，我国第一部药物学专著神农本草经就记载了杜仲皮的神奇药效，主治“腰膝痛、补中、益精气、坚筋骨、强志、除阴下痒湿，小便馀沥，久服轻身耐老”，并把杜仲列为中药上品1。传统加工方法发汗能使杜仲内皮颜色变暗2, 但就目前研究未涉及发汗原理。本文采用高效液湘色谱法, 对发汗前后杜仲对血管紧张素转化酶抑制率进行了比较3，为传统发汗方法研究提供数据参考。1.材料与方法1.1材料与方法马脲酸（hippuric acid），卡托普利（CAPTOPRIL），HHT(hippuryl-histidyl-L-leucine:马脲酸-组氨酸-L-白氨酸)均购买于Sigma公司。色谱纯乙腈购买于B&J公司。分析纯甲醇购买于北京化工厂。水为娃哈哈纯净水。ACE由实验室自制，从兔肺中分离得到。1.2 药材 发汗前后杜仲药材：江西万载县5批，江西樟树县6批，贵州10批。采收方法：在离地约50 cm处割一刀，深度大约为韧皮部厚度的3/4，宽度约2-3 cm，以此为起点向上1 m处，对准下部刀割处割第二道切口，在两切口间纵割一切口，用竹片沿切口将整张树皮剥下。每棵树采集到的分为2份，1份自然晾干，1份进行发汗处理：将皮的内面双双相对，层层重叠、压紧，堆积放置于平地，以稻草垫底，四面用稻草盖好，上盖木板，井加石块压平，再用稻草覆盖，经67天闷压发热。样品干燥后，粉碎，待用。2实验与结果2.1色谱条件色谱柱：YMC (YMC-Pack ODS-A, AA12S05-2546WT, 5 m , 12 nm, 250 4.6 mm I.D.) ；流动相：乙腈:水=15:85；流速：1mLmin-1；检测波长：228 nm；柱温：25 ；进样量：10 L.（A）(B)图1 液相色谱图（A-空白组，B-反应组；1-马脲酸）Fig.1 The chromatograms of reaction determined by HPLC(A- blank group, B-reaction group; 1- hippuric acid)2.2 试剂的配置HHL溶液：取HHL适量，以0.1 molL-1磷酸缓冲液(pH=8.3，含0.3 molL-1 NaC1)配成4.0mmoL-1 HHL溶液卡托普利溶液：按所需浓度，取适量卡托普利样品，用0.1 molL-1磷酸缓冲液(pH=8.3，含0.3 molL-1 NaC1)溶解，再用同种缓冲液稀释到所需浓度。马脲酸标准液：取马脲酸标准品适量用双蒸水配制成不同浓度的马脲酸标准液。2.3药物提取精确称取样品1.0g，50 ml80%甲醇超声提取30 min(n=3)，过滤，合并滤液，水浴蒸干。取干燥提取物2 mg，加入50 LDMSO溶解，待用。2.4 ACE活性抑制剂（ACEI）活性的检测HHL溶液与空白血浆反应的总体积为100 l。空白对照组的组成为：40 l HHL溶液、30 l缓冲溶液和40 l空白血浆；对应实验组的组成为：40 lHHL溶液、30 l抑制剂溶液(卡托普利或中药提取物溶液)、40 l空白血浆。在37 恒温水浴中反应40 min后，加入120 l乙腈终止反应，震荡10 s后，离心10 min(10000 rpm)，取上清液进样l0 l。2.5 测定原理HHL和ACE恒温水浴时，能在ACE的催化下水解生成马脲酸。实验组的ACE活性受到ACEI的抑制作用要比对照组生成的马脲酸的量要少。因此，可以通过检测马脲酸的生成量来评价ACEI对ACE活性的抑制率。计算公式为：R = (1- B/A)100式中， 为ACEI样品对ACE活性的抑制率，A为对照组生成马脲酸的峰面积，B为实验组生成马脲酸的峰面积。2.6 样品测定结果按照2.1及2.4项下操作，对样品进行测定，结果见表1、图2。 表1 杜仲发汗前后样品ACE抑制率实验结果Table 1 The result on ACE inhibition ratio of samplesNo.产地ACE抑制率（发汗前）ACE抑制率（发汗后）1贵州88.7%65.4%2贵州82.5%66.0%3贵州76.3%94.3%4贵州89.7%83.1%5贵州42.8%12.3%6贵州78.4%73.6%7贵州41.0%28.4%8贵州52.8%42.3%9贵州65.5%28.5%10贵州89.2%86.9%11江西万载88.3%55.2%12江西万载86.5%30.5%13江西万载84.8%46.2%14江西万载79.0%84.6%15江西万载84.4%48.6%16江西樟树87.6%88.4%17江西樟树88.6%83.6%18江西樟树81.8%77.8%19江西樟树76.7%60.1%20江西樟树75.3%90.8%21江西樟树81.4%90.3%图2 杜仲发汗前后样品ACE抑制率实验结果Fig.2 The result on ACE inhibition ratio of samples3.讨论3.1方法学考察3.1.1标准曲线精密称取马脲酸标准品12.5 mg置10 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，摇匀，将对照品溶液稀释成不同的浓度0.01，0.03，0.09，0.27，0.81mmolmL-1，精密吸取不同浓度的标准品溶液10 l分别进样测定，标准曲线方程为：Y=3E+07X-147201，r=0.9999，表明马脲酸标准品在0.010.81 mmolmL-1范围内线性关系良好。3.1.2精密度取一定浓度对照品溶液连续测定6次，测定峰面积，结果其RSD为0.34%，表明仪器精密度良好。3.1.3稳定性取对照品溶液于室温放置0，2，4，6，8，10 h后分别测定峰面积，RSD为0.79%。表明对照品在10 h内稳定。3.1.5回收率在未经反应的对照组溶液中，分别加入浓度为0.01，0.1，0.8 mmolmL-1的标准马脲酸溶液，再按2.3的方法处理样品，通过检测并计算马脲酸的平均回收率来考察该方法处理样品的准确性，结果如表1所示。马脲酸的回收率在95.8%-105.0%之间，RSD为1.97(n=9)。表2 回收率实验结果Table 1 The result of recovery No.加入量（mmolmL-1）回收率（%）10.0197.120.0198.530.01100.440.197.750.199.460.198.170.8103.280.897.790.897.33.2 卡托普利对ACE抑制活性的检测随着卡托普利浓度的不断提高，对ACE的抑制率也呈上升趋势，经计算其IC50值为28.19 nmolmL-1。不同文献报道卡托普利对ACE的活性抑制率是不同的 ，其IC50值范围在7.510-10 -2.210-8 molmL-1之间，本方法所得到的卡托普利的IC50值也在这个范围之内，说明本方法具有可行性。结果见图3。 图2 卡托普利ACE抑制率实验结果 图3 卡托普利对ACE抑制活性检测结果Fig.3 The result on ACE inhibition ratio of Captopril3.3 利用SPSS软件分析表1中两组数据，结果P=0.0390.05，表明两组数据有显著性差异。21批样品中有4批发汗后杜仲ACE抑制率高于发汗前，其中3批采自江西。结果表明，从血管紧张素转化酶抑制率角度并不能完全解释传统发汗的原理。实验结果与传统发汗并不一致，药材产地可能是其中一个原因。对于传统发汗原理的研究还需要进行更深入的分析，包括成分的变化，主要药效成分含量的变化、微生物变化等。本实验以期为传统发汗方法研究提供数据参考。参考文献1WANG L N, YANG M H. The development of Eucommiae ulmoides.J. Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发),2008,20:146-155.2YANG H B, ZHAN Y H, CHEN K L, et al. The effect of sweating andremove the peel on the component content of phenols in Magnolia off icinalis Rehd1