实验一、机械搅拌发酵罐的使用及细菌纤维素的发酵制备.doc

实验一、机械搅拌发酵罐的使用及细菌纤维素的发酵制备一、实验原理与目的微生物生长受到自身代谢特性和环境的影响。在分批培养中，随着微生物的生长、基质消耗、代谢产物的积累，环境发生改变，从而对微生物代谢产生影响。所以测定代谢过程的参数，如菌浓、基质浓度、pH、溶氧浓度等，并对这些参数进行分析，可以使人们对微生物培养过程有一个量化的了解，检测代谢参数是过程控制与优化的前提。本实验使学生掌握测定菌体浓度、基质消耗、产物生成、各种参数的方法，学会分析这些参数的相互关系。 本实验在3L发酵罐中进行细菌培养。通过测定菌体浓度了解细菌的生长规律，通过测定葡萄糖的消耗了解底物利用，通过测定纤维素产量了解产物生成，分析菌体生长与底物消耗、产物生成的关系。同时检测发酵过程中的溶氧、pH等。二、实验步骤1.发酵罐准备1）清洗。发酵罐培养前后进行清洗（空气分布器、取样管内部、取样平衡口、顶板放零件的小间隙），外壁、底板、顶板擦干净。2）连接：进行发酵之前要对发酵系统（空气压缩系统、冷却系统、发酵流加系统及在线控制系统）进行调试。主要工作是检查通气与冷凝水管道的连接正确与否、管道是否破损堵塞、空压机能否正常工作、在线控制系统是否正常。连接发酵罐、PH 控制器、DO控制器等电源。注意不漏电和接错线。3）空罐灭菌：将发酵罐充分清洗干净，罐内装适量去离子水，盖好罐盖，接好管路，pH 电极和溶氧电极不需要空消，连接完毕后将发酵罐整体放在灭菌锅中，灭菌温度121，时间 20min。2.电极标定1）pH 电极标定 pH 电极零点和斜率要在进行灭菌以前进行，电极在使用前先用蒸馏水清洗并检查电极信号有无故障，然后再进行标定。一般而言如果发酵液偏酸性我们用6.86 和 4.00 的缓冲液，如果偏碱性则配制 6.86 和 9.18 的缓冲液。 点击控制器屏幕画面下方的“标定”，弹出标定菜单，选择相应罐（F1-F4）下的“pH 电极”，弹出相应的 pH 电极标定界面。先进行零点标定，以酸性为例，将 pH 电极联好电极线用蒸馏水洗净后插入 pH6.86 的标准液中，点击“零点值”，输入 6.86，然后点击“开始”，待采样值完全稳定后点击“结束” 。然后用蒸馏水清洗电极探测头后插入 pH4.01 的标准液中，同样方法输入斜率值 4.01 来标定斜率。接下来将 PH 电极插在发酵罐上与培养基一起进行灭菌，并用纱布和牛皮纸将电极的金属头包住，以免接触到水。实消后，冷却下来，连上电极线，接到灌上，这时 PH 电极将信号传给控制系统并显示发酵罐内发酵液的 PH 值。在发酵控制台上设定需要控制的PH，控制系统会通过流加酸碱控制PH。也可不控制PH，通过电极对发酵过程的 PH 变化进行检测。2）溶氧电极的标定溶氧电极的零点要在灭菌以前标定，斜率必须在灭菌后接种前，当温度等各项培养条件都满足发酵工艺的要求是进行标定。 标定方法类似于 pH 电极的标定，点击控制器屏幕画面下方的“标定” ，弹出标定菜单，选择相应罐（F1-F4）下的“溶氧电极”，弹出相应的溶氧电极标定界面。灭菌前先标定零点，标定液一般为饱和的无水亚硫酸钠溶液，输入零点值为1%，点击“开始”，待采样稳定后结束。在发酵罐实消之后，把通气、搅拌转速、温度等参数调整到设定值，待各参数稳定满足发酵条件后，进入相应罐的溶氧电极标定画面，输入斜率值 100%进行斜率标定。使用时与 PH 电极一样，将溶氧电极装入发酵罐与培养基一起进行实消灭菌，并用纱布和牛皮纸将电极的金属头包住，以免接触到水。实消完成后，待冷却后，连接电极线，连接到发酵罐的控制系统。3.实罐灭菌配制培养基（3L 发酵罐装培养基 2L）及种子液，种子液体积按 8%的装液量即160ml，置于30摇床160rpm下培养 24小时。将配好的培养基倒入罐内，硅胶管连接取样管路并用弹簧夹夹住，防止培养基在灭菌时流出；连接补料管路（包括酸、碱、消泡、补料） ；空气过滤器用硅胶管与罐体空气管连接并用弹簧夹夹住；将电极装入电极插口并用盖子或铝箔封好，防止插口受潮；排气口硅胶管用纱布和牛皮纸包好；盖紧其它罐盖接口。将罐体和补料瓶放入灭菌锅，灭菌 121，20 min。灭菌锅灭菌结束需自然冷却，禁止放气。4. 参数设定灭菌结束后应尽快将罐放回原位，连接夹套冷却水管路和尾气冷凝管路，连接通气管路，插入温度电极，连接 pH 和溶氧电极。打开冷却水进出水管，设定过程参数：直接点击触控屏上的相关参数即进入设定界面，直接手动输入即可设定温度、pH、搅拌转速等参数，并可设置手动或自动控制。将温度设置成“自动”，夹套进水让培养基冷却，打开通气冷凝，调节空气流量转子调整适当的通气量，等参数稳定后，进入溶氧标定界面标定溶氧斜率为 100%后，即可进入发酵过程。5. 接种旋松接种口，在火焰保护下，打开接种口，倒入种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。6. 取样接种时取第一个样，每隔 12 小时取一次样，每次取 10ml 左右（用 15ml 离心管取并记录取样体积） 。将取样管放入废液瓶，松开取样管弹簧夹，捏紧平衡管，当取样管内残液放去15mL左右后用取样瓶接收样品，取样结束后松开平衡管并夹住取样管。如取样困难，可以夹住排气管，增加罐压，加速取样。7. 下罐和清洗发酵 6 天后（或还原糖含量1%）发酵结束，进行下罐和清洗，将温度设定设置为手动，除去温度电极停止加热，关闭通气、冷凝，流加管等拔掉，把溶氧电极和 PH 电极拔掉清洗干净收好。把发酵液倒掉并清洗。三、实验结果1.还原糖测定的标准曲线的制定1) 标糖的配制：将烘干至恒重的葡萄糖（在 80烘箱中过夜）称取 0.5g，溶解于250mL容量瓶中（2mg/ml），标糖必须现配现用； 2) 标糖的加样：标糖0.1mL0.2mL0.3mL0.4mL0.5mL0.6mL0.7mL0.8mL0.9mL1.0mL水0.9mL0.8mL0.7mL0.6mL0.5mL0.4mL0.3mL0.2mL0.1mL0.1mL糖浓度（mg/ml）0.20.40.60.81.01.21.41.61.82.03) 将上面表格添加的试管中（25mL 规格）加入 3mLDNS 试剂，沸水浴 5min，取出后，加去离子水补至 25mL，冷却混匀后，在可见光分光光度计 550nm，测出被测溶液的吸光度；结果如下： 糖浓度（mg/mL）0.20.40.60.81.01.21.41.61.8OD值0.16340.36030.54030.71350.89691.07361.26521.45841.61434) 以葡萄糖浓度为纵坐标，吸光值为横坐标，做出标准曲线，计算回归方程。方程如下：表.标准曲线及方程2.实际样品的还原糖测定取50l样品，加1950l无菌水，加入 3mL 的 DNS，方法与标准曲线的测定一样。根据所测到的吸光值，代入标准曲线的回归方程，再乘以样品稀释的倍数，即得到残糖含量（g/L）。时间（h）024487296120144168OD值0.82580.72050.58050.43150.14820.25380.22450.2948稀释后含量(g/L)0.92010.80430.65030.48650.17490.29100.25880.3361残糖含量（g/L）36.804632.172226.013419.45856.995611.641210.352213.4448表1.实际样品中还原糖的测定3.纤维素产量测定离心后的沉淀物抽滤到定量滤纸上（事先将定量滤纸置于烘箱中 105烘干约 1h，冷却至室温后称重记为W1）并放于 105烘箱中烘干至恒重（一般 12天），称重记为W2，即可计算出所取样品中细菌纤维素粗产物量为W2W1（g/L）。至发酵结束，即可绘制出纤维素产量随时间的动态变化。发酵结束后，将发酵液倒出测量体积，同样方法离心收集沉淀产物并于 105烘干称重。也可算得该罐产量（g/L） 。注意罐壁和搅拌结构上粘附的产物也要收集，减少损失。时间（h）024487296120144168取样体积（ml）12.712.613.112.512.012.712.813.2滤纸质量W1(g)0.50580.51140.50730.50990.51220.51130.52500.5177样品质量W2(g)0.50580.51580.57520.60400.58030.57790.56370.6046净重（g）00.00440.06790.09410.06810.06660.03870.0869浓度（g/L）00.34925.18327.52805.67505.24413.02346.5833表2.实际样品中纤维素含量的测定图1.残糖含量变化表图2：纤维素产量变化表编号滤纸质量（g）样品质量（g）净重（g）10.51531.90371.388420.52062.26681.746230.51682.18021.663440.51462.00161.48750.51312.18221.669160.51842.13611.617770.51891.90731.388480.5211.70581.184890.51532.33111.8158100.51242.17191.6595总重5.166420.786715.6203表3.总纤维素量的测定经测量，发酵液的总体积为：1.52L所以该罐的产量为=总质量/总体积=15.6203g/1.52L=10.2765g/L四、分析与讨论1.对取样样品进行还原糖的测定从96h至168h，还原糖的量出现了