整合素表达对硬皮病成纤维细胞合成原胶原的影响.doc

整合素表达对硬皮病成纤维细胞合成原胶原的影响整合素表达对硬皮病成纤维细胞合成原胶原的影响中华皮肤科杂志 1998年第4期第31卷 论著作者：洪微廖万清孔宪涛陈敏亮李志刚何金单位：200003 上海，第二军医大学附属长征医院皮肤科(洪微廖万清李志刚)，实验科(孔宪涛)，整形外科(陈敏亮)，病理科(何金)关键词：硬皮病；系统性；硬皮病；局限性；成纤维细胞；结合素类；原胶原【摘要】目的研究硬皮病成纤维细胞整合素表达对成纤维细胞合成原胶原的影响。方法运用硫代修饰的整合素反义寡核苷酸阻断硬皮病成纤维细胞表面相应整合素亚基的表达，RT-PCR检测整合素表达抑制后硬皮病成纤维细胞原胶原mRNA量的变化。结果反义寡核苷酸能特异抑制硬皮病成纤维细胞相应整合素亚基的表达；整合素或亚基表达减少的成纤维细胞，原胶原pro()、pro() mRNA均显著降低。结论降低硬皮病成纤维细胞整合素的表达，可从转录水平抑制成纤维细胞合成原胶原。Effect of Integrin Expression on Procollagen Synthesis of Fibroblasts from SclerodermaHong Wei, Liao Wanqin, Kong Xiantao, et al. Department of Dermatology, Changzheng Hospital, the Secend Military Medical University, Shanghai 200003【Abstract】ObjectiveInvestigation of the effect of integrinon fibroblasts from scleroderma in the production of procollagen.Methods Phosphorothioate modified antisense oligonucleotides were used to interfere with the expression of integrin or subunit on scleroderma fibroblasts respectively, then the changes of procollagen mRNA were detected by RT-PCR. Results The expressionof integrin or subunit could be specifically inhibited by their antisense oligonucleotides respectively. Decreased expression of fibroblast integrin or subunit significantly lowered mRNA of procollagen () and 1().Conclusion Overproduction of procollagen may be inhibited in the level of transcription by lowering the expression of integrin on fibroblasts in scleroderma.【Key Words】Scleroderma, systemicScleroderma, circumscribedFibroblastsIntegrinsProcollagen硬皮病的重要病理特征是以胶原为主的细胞外基质(extracelluar matrix, ECM)合成增多并过量沉积于皮肤及内脏器官。真皮成纤维细胞(FB)是合成ECM的主要细胞，已证实硬皮病皮损中存在着高产量胶原的异常FB亚群1，但其表型特征及激活机制均不清楚。FB表面粘附分子整合素家族是介导FB-ECM间作用的主要受体，近年来国外有报道硬皮病皮损中整合素表达增加2，但硬皮病中整合素表达增加的病理意义以及与FB合成原胶原间的关系尚不清楚。我们运用反义寡核苷酸阻断硬皮病FB表面整合素的表达，进而观察整合素表达变化对FB合成原胶原的影响，明确整合素在硬皮病FB合成原胶原中的作用。材料和方法(一)临床资料：硬皮病患者10例，经临床及病理诊断证实，除1例患儿为额部斑块性硬皮病，余9例为系统性硬皮病；病程216个月不等，男2例，女8例，平均年龄28.2岁。(二)主要试剂：1.反义寡核苷酸及正义、无意义寡核苷酸对照：由美国Cybrasn公司经DNA合成仪合成，经硫代修饰、高压液相色谱纯化，其序列如下3：antisense-5：5-TCCAGAAGCATTGAGGCAGAA-3；1581-1602。sense-：3-AGGTCTTCGTAACTCCGACTT-5；anti-sense-：5-GCAGTAAGCATCCATATC-3；1643-1661。sense-：3-CGTCATTCGTAGGTATAG-5；nonsense：5-CATGGCGCGGGCCGCGGG-3。2.引物：由中国科学院生物化学研究所合成，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。pro1()4：5-CCTGGCAAAGATGCACTC-3，3-GAAATTGTCTCCCATTTTTTTGGC-5；pro()5：5-CTTGGGATGGCTGGGATCACT-3，3-CATCAGGACTAATGAGGCTTT-5；内对照GADPH6：5-GCAATGTGCATGTGTCTGTG-3，3-TTACCCAGGCTGAGTACTGCT-5。3.抗体：抗、单抗购于Immunotech公司。4.LSAB组合试剂盒为Dako公司产品，总RNA提取试剂盒购于Qiagen公司，Taq聚合酶及反转录试剂盒购于宝灵曼公司和Gibco BRL公司。(三)FB的培养：选取新鲜皮损无菌取材，采用组织块法进行原代培养，当细胞处于对数生长期，密度达70%时，以0.25%胰酶13消化传代，10例患者皮损FB均取第25代FB为研究对象。(四)反义寡核苷酸对硬皮病FB整合素表达的阻断：取FB 110以生理盐水冲洗2遍后，将整合素、亚基反义寡核苷酸用DMEM充分溶解后加入无血清DMEM培养基，终浓度为50mol/L，与FB共孵育8小时。每种反义寡核苷酸均设正义、无意义寡核苷酸对照及阴性对照。(五)FB整合素表达的检测：取对数生长期FB 0.25%胰酶消化传代至六孔板中经酸和乙醇处理的盖玻片上，待FB在盖玻片表面贴壁并展开，即按方法(四)所述进行反义寡核苷酸阻断实验，37 CO孵箱孵育8小时后，丙酮4固定15分钟。PBS洗后，0.3%过氧化氢甲醇处理10分钟；PBS洗后滴加正常猪血清(110)，室温30分钟；再分别滴加抗整合素、1单抗(1200)，4湿盒过夜；PBS洗后加生物素标记的兔抗鼠抗体(1400)37孵育30分钟；PBS洗，加过氧化物酶标记的链霉亲和素(1400)30分钟；PBS洗，DAB显色，苏木素衬染，常规脱水，透明，封片。镜检观察结果，棕黄色为阳性。(六)硬皮病FB原胶原合成的检测(RT-PCR法)：1.将处于对数生长期的第25代硬皮病FB 10例，每例210按上述方法(四)所述与反义寡核苷酸作用以阻断FB相应整合素的表达，提取RNA(步骤参见Qiagen说明书)，变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整，紫外分光光度计定量。2.反转录：取RNA 4g，加入oligo(dT)1l，DEPC处理的水至体积12l，依照Gibco BRL公司反转录试剂盒说明书进行反转录。3.PCR pro()、pro()及GADPH：取反转录产物cDNA 2l，引物以100l TE溶解后，各取1l，10PCR buffer 2l，10mmol/L dNTP 1l，Taq酶2U，25mmol/L MgCl 1.6l(终浓度2.0mmol/L)，加水至终体积为20l，混匀，离心，以矿物油覆盖。置PCR仪94 5分钟；(94 1分钟、55 1分钟、72 30秒)30循环，72 5分钟。1.5%琼脂糖电泳，照像，并对PCR电泳条带进行计算机灰度扫描。(七)计算机图像分析：1.免疫组化检测FB整合素表达的分析：显微镜下每张细胞爬片任取三个视野，根据每个视野阳性细胞所占面积及平均灰度值，二值相乘得面积灰度值，再计算三个视野的平均面积灰度值，作为表达阳性的相对量化值。2.RT-PCR产物电泳图分析：以每例细胞pro()、pro()电泳带面积灰度值与内对照电泳带面积灰度值之比值，作为该例细胞pro()、pro()表达的相对数值。(八)统计学处理：采用配对计量资料的t检验。结果(一)整合素反义寡核苷酸对硬皮病皮损FB整合素、亚基表达的抑制：经整合素、亚基反义寡核苷酸作用的硬皮病FB，其表面相应整合素亚基的表达明显减少(P0.01)，而经正义及无意义寡核苷酸作用的FB，5、亚基表达均无显著变化(P值均0.05)，见表1。(二)硬皮病FB整合素、亚基表达减少对FB原胶原合成的影响：整合素或亚基表达受抑制的硬皮病FB，原胶原pro() mRNA减少(P值均0.05)，pro() mRNA显著减少(P值均0.01)。而经正义及无意义寡核苷酸作用的FB，原胶原pro()、pro() mRNA量无显著变化(P值均0.05)。如表2、3所示。表1反义寡核苷酸对10例硬皮病成纤维细胞相应整合素亚基表达的抑制分组亚基亚基平均数*t值P值平均数*t值P值阴性对照组5500-8462-反义寡核苷酸组202143.510.012800129.320.01正义寡核苷酸组54101.4480.0578661.3300.05无意义寡核苷酸组53122.1570.0578641.4620.05*为面积灰度值平均数表2整合素亚基表达减少对硬皮病成纤维细胞合成原胶原的影响分组pro()pro()平均数*t值P值平均数*t值P值阴性对照组3.753-3.339-表达减少组2.16766.240.011.96358.430.01正义寡核苷酸组3.3571.3010.053.0392.2470.05无意义寡核苷酸组3.4102.0350.053.0422.2330.05*原胶原mRNA相对量化值平均数(10例)表3整合素亚基表达减少对硬皮病成纤维细胞合成原胶原的影响分组pro()pro()平均数*t值P值平均数*t值P值阴性对照组3.753-3.339-表达减少组1.76720.740.011.55917.550.01正义寡核苷酸组3.8362.1530.053.1321.9780.05无意义寡核苷酸组3.4102.0960.053.1561.8620.05*为原胶原mRNA相对量化值平均数(10例)讨论近年来ECM-细胞间相互作用在纤维化中的意义正引起关注，国外曾有报道硬皮病FB与、型胶原以及纤连蛋白(fibronectin, Fn)、层粘连蛋白间粘附性增加，并且仅存在于培养早期(6代之前)的皮损FB7，这与硬皮病FB合成原胶原增多也仅在培养早期出现有一致之处。提示硬皮病FB与ECM间粘附作用，与FB合成原胶原的多少可能存在关联，但尚缺乏直接的证据。整合素、亚基是介导Fn-FB间作用的粘附分子，在硬皮病皮损FB表面表达较正常FB显著增强2，我们运用硫代修饰的整合素反义寡核苷酸与硬皮病FB作用，结果显示反义寡核苷酸分别能抑制FB相应整合素亚基的表达，而经正义及无意义寡核苷酸作用的FB，整合素表达无变化。表明反义寡核苷酸对整合素表达的抑制是特异性的。反义寡核苷酸通过胞吞作用被细胞摄取，主要通过以下途径抑制特定基因的表达8：被动结合，干扰mRNA由核向胞浆转运；直接效应，降解靶序列；激活核糖核酸酶；选择裂解；抑制转录。反义寡核苷酸经硫代修饰后能抵抗核酸酶的降解，稳定性增强，半衰期由修饰前的5分钟延长至修饰后的数小时至十几小时9。经反义寡核苷酸阻断硬皮病FB整合素或亚基表达后，进一步研究了整合素表达减少的FB，原胶原pro()、pro() mRNA的变化。结果显示整合素或亚基表达减少的硬皮病FB，pro() mRNA、pro() mRNA均显著降低，而正义和无意义寡核苷酸作用组FB，原胶原的表达无明显变化，从而排除了原胶原mRNA减少是寡核苷酸的毒性作用或非特异性作用的可能。表明阻断硬皮病FB整合素或亚基表达，可从转录水平抑制硬皮病FB合成原胶原。整合素、介导FB与Fn粘附后，可引起一系列生物学效应1：粘附分子在细胞表面成簇；激活酪氨酸激酶系统；肌动蛋白表达增加。最直接的效应就是细胞骨架成分微管收缩，导致FB的迁移、聚集。整合素反义寡核苷酸阻断了FB整合素或亚基表达后，FB合成原胶原mRNA减少可能与上述一系列效应被抑制有关，有待于进一步研究证实。参考文献1 Kahari VM, Sandberrg M, Kalimo H, et al. Identificationof fibroblasts responsible for increased collagen production in localized scleroderma by in situ hybridization. J Invest Dermatol, 1988,90664-670.2 Gruschwitz M, Von den Driesch P, Kellner I, et al. Expression of adhesion proteins involved in cell-cell and cell-matrix interactions in the skin of patientswith progressive systemic sclerosis. J Am Acad Dermatol, 1992,27169-177.3 Thomas L, Mariznne BF. Inhibition of neural crest cell attachment byintegrin antisense oligonucleotides. Science, 1993,259692-695.4 Tromp G, Kuivaniemi H, Stacey A, et al. Structure of a full length cDNAclone for the prepro() chain of human type procollagen. Biochem J, 1988,253919-922.5 Ala-kokko L, Kontusaari S, Baldwin CT, et al. Sturcture of cDNA clonescoding forthe entire pro() chain of human type procollagen. Biochem J, 1989,260509-516.6 Lipman ML, St