一种磷脂酶A2抑制剂体外高通量筛选方法的建立.doc

一种磷脂酶A2抑制剂体外高通量筛选方法的建立朱京童 郑智慧 路新华 范玉玲 张华 贺建功（华北制药集团新药研究开发中心，微生物药物国家工程研究中心 石家庄050015）摘要：目的：磷脂酶A2(PLA2)是一个重要的抗炎和心血管疾病药物靶点，本研究拟建立一种荧光的磷脂酶A2 (PLA2)抑制剂体外高通量药物筛选方法。方法：以7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate为荧光底物，水解产物在355ex/460em下有特定荧光，间接反映酶活性。利用96孔板，通过对酶浓度、反应时间等多个条件的优化，摸索最佳的反应条件。利用阳性药二乙烯三胺五乙酸进行模型验证。结果：在酶浓度2.25U/ml、底物浓度30M和反应时间30min时，为最适反应条件。阳性药在该模型上表现出好的浓度剂量依赖抑制效果，IC50为0.37mol/L。利用该模型，本研究从微生物次生代谢产物筛选得到两个活性化合物F02ZA-2396A、F02ZA-2396B，其IC50分别为152M和72M。结论：本研究建立了一个高通量的磷脂酶A2抑制剂体外药物筛选方法，该方法灵敏、快捷、可操作强，可用于各种来源的化合物的快速活性筛选。关键词：磷脂酶A2；抑制剂；体外；荧光法A fluorescence-based method on the high throughput screening assay for PLA2 inhibitor in vitroZhu Jing-tong, Zheng Zhi-hui, Lu Xin-hua, Fan Yu-ling, Zhang Hua, He Jian-gong(New Drugs Research & Development Center of North China Pharmaceutical Group Corporation, National Microbial Medicine Engineering & Research Center, Shijiazhuang 050015)ABSTRACT: OBJECTIVE: To establish a fluorescence-based method in vitro for high throughput screening phosphplipase A2(PLA2) inhibitor. METHODS: using 7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate as a fluorescent substrate，to determine the activity of phosphplipase A2 by measuring the 355ex/460em fluorescence value in 96-well microplates, The effect of positive drugs and samples on phosphplipase A2 activity were evaluated. RESULTS: With 2.25U/ml concentration of the enzyme, 30M concentration of the substrate and 30 min reaction time, there is a dose-dependent manner between them. Positive control, DTPA showed good inhibitory activity in dose-dependent manner with IC50 of 0.37mol/L , In the course of screening for PLA2 inhibitors from metabolites of microorganisms, two compounds named F02ZA-2396A and F02ZA-2396B were conformed as the PLA2 inhibitors, their IC50 value are 152mol/l and 72mol/l，respectively. CONCLUSION:The method is sensive, rapid, accurate valid for screening the PLA2 inhibitors in vitro.KEY WORDS: phosphplipase A2 ;inhibitor; in vitro; fluorescence作者简介：朱京童，（1977年出生），女，硕士在读，工程师。研究方向：药物筛选基金资助：国家科技部创新药物筛选技术平台研究资助项目，项目编号：2002AA2AZ343D通信地址：E-mail:zhujingtong2003磷脂酶A2(phospholipase A2 PLA2)是一种重要的代谢和调节酶类，已有150个以上的氨基酸序列可在蛋白质序列库中找到1。在生物界中分布广泛，大量存在于蛇毒、蜂毒、蝎毒，动物胰脏及植物组织中2。所有的PLA2都有一种最基本的作用，就是水解磷脂sn-2位脂肪酸，释放自由脂肪酸和溶血磷脂，直接或间接作用于靶细胞，广泛参与人体生理性细胞内外信号的传递及炎症、多种炎症相关疾病等多种病理过程。是花生四烯酸、溶血磷脂等炎性介质生成的限速酶，促进了一系列炎性介质和细胞因子的大量释放和激活，是前列腺素和血小板活化因子生成的关键酶，在炎性病变的发生和发展过程中起重要的作用，直接影响其发展和预后3。因此磷脂酶A2抑制剂近年来越来越引起了人们的极大关注。为了寻找新的PLA2抑制剂，本研究利用荧光方法建立了一种高通量的PLA2抑制剂体外筛选模型，该模型的建立为从微生物的次生代谢库、合成化合物库以及植物来源的化合物中发现新的PLA2抑制剂，研究开发新的PLA2抑制剂药物研发奠定基础。1 材料与方法1.1 筛选用微生物菌株 放线菌和真菌由本室微生物菌种库提供，微生物的代谢产物经溶媒提取，DMSO溶解作为筛选样品。1.2 试剂及仪器 磷脂酶A2（PLA2）购自Sigma公司,荧光多肽底物7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate购自BIO-MOL公司；二乙烯三胺五乙酸（Diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA）购自Sigma公司；Victor1420多标计数仪（美国PE公司）1.3 PLA2活性测定原理及方法测活原理与方法参考文献4,5，并稍加改动。缓冲液配方：50mM Tris-HCL ,25mM CaCL2（PH 8.0）。缓冲液预先保存于4C。以荧光标记的多肽7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate为底物，利用水解后的产物在355ex/460em的荧光读值，通过测定酶反应前后荧光F值的变化，确定PLA2酶的活性。反应式如下： PLA2 7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate 7-Hydroxycoumarinyl + arachidonate（355ex/460em） 筛选的操作过程为6：在96孔板中加入测试样品（DMSO溶解）2l/孔，用等体积DMSO作为对照，加PLA2酶液35l/孔。使用1420 Victor2多标计数仪在355/460nm波长下，读取每孔F1值（样品本底F1）；加入底物15l， 37保温反应30分钟后再次读取每孔的F2值，并计算抑制率，样品抑制率(I%) 100%F2 - F1 (对照) F2 - F1 (样品)F2 - F1 (对照) F2 - F1 (空白)1.4 真菌F02ZA2396A、F02ZA2396B的培养将菌株斜面接种于种子培养基（淀粉2%，葡萄糖1%，黄豆饼粉0.2%，麦芽粉0.6%, 酵母0.5%, CaCO3 0.2%，MgSO47H2ONaCl 0.2%，pH 7.0），27 摇瓶培养3天。按1%接种的量接种发酵培养基 (淀粉1.0%，葡萄糖2%，黄豆饼粉1.3%，酵母粉0.4%，麦芽粉0.8%，NaCl 0.05%, CaCO3 0.15%, pH 7.0) 27振摇培养6天。1.5模型的验证：Z因子是评估测试方法质量的主要参数7。Z=1-3x(SDs+SDb)/MS-MB，(SD=标准差, s=信号, b=背景)。范围可以从1到小于0。在测试方法的建立确证和高通量筛选的过程中，Z因子应大于0.4。2.实验结果2.1 不同酶浓度与水解产物生成量（F值）的关系 为了确定最佳的酶反应浓度，固定底物浓度30M和反应时间30min，将酶液进行稀释。酶起始终浓度72 U/ml，后二倍梯度稀释12个浓度组（至0.03 U/ml）进行活性测定。结果（图1）显示，酶浓度在0.282.25U/ml间与F值呈良好线性关系。当酶浓度大于2.25U/ml，F值转向平衡。该模型的酶量从线性范围较好的酶浓度确定，本研究选择酶浓度为2.25 U/ml。 图1 不同酶浓度与F值变化的关系2.2 反应时间与水解产物生成量（F值）的关系 为了确定最佳的反应时间，利用96孔板，在底物终浓度为30M、酶浓度2.25 U/ml的条件下，测定不同反应时间（0min180min，每隔5min测定一次）与F值的关系。图2显示在反应时间为35分钟范围内与F值之间均呈很好的线性关系。反应35分钟后，F值渐趋向平衡。根据结果，选择线性范围内反应时间（0 - 35min），所以将模型筛选时反应时间控制为30分钟左右。图2 不同反应时间与F值变化的关系2.3 阳性对照二乙烯三胺五乙酸对PLA2的抑制活性 为了验证所建立模型的灵敏度和稳定性，本研究利用已报道的PLA2的抑制剂二乙烯三胺五乙酸（图3）作为阳性药物。固定底物浓度30M、酶浓度2.25U/ml和反应时间30min，二乙烯三胺五乙酸起始终浓度为100mol/L ，后二倍梯度稀释18个浓度组进行抑制活性测定。结果（图4）表明二乙烯三胺五乙酸在该模型上表现出强的抑制活性，在0.00625mol/L间并具有较好的量效关系，其IC50为0.37mol/L。筛选模型的Z因子0.87 ,信噪比（S/B）5。 图3二乙烯三胺五乙酸的化学结构图4 二乙烯三胺五乙酸对PLA2的抑制曲线2.4 F02ZA2396A 、F02ZA2396B对PLA2活性抑制作用 在酶浓度2.25U/ml，底物浓度30M下，37C反应25分钟，对F02ZA2396A（图5）、F02ZA2396B（图5）进行活性测定。样品起始终浓度为80g/ml，后三倍梯度稀释8个浓度组，根据结果计算两个化合物的IC50值分别为152M、72M。 F02ZA2396A F02ZA2396B图5 F02ZA2396A、F02ZA2396B的化学结构3 讨论：磷脂酶A2由于参与体内免疫、信号传递和炎症反应等多种生物作用而受到越来越多的重视。从当前的研究结果看，磷脂酶A2在抗菌、抗炎症方面，甚至在治疗某些心血管疾病及神经系统疾病中有着广泛的应用前景。动脉粥样硬化是心血管疾病的病理生理基础，是西方发达国家的主要死亡原因。随着我国人民生活水平提高和饮食习惯改变，也成为我国主要死亡原因。防治动脉粥样硬化是目前医学领域急需解决的一个重要课题。当前对动脉粥样硬化的治疗仍以降脂药物为主。PLA2 作为一个非降脂药物发现的新靶点,其抑制剂对动脉粥样硬化疾病的预防和治疗具有着广阔的应用前景。 PLA2活性测定方法很多，包括滴定法8、指示剂比色法9、荧光标记法10，11、放射标记法12，13等。但上面些方法因其操作繁琐、灵敏度差、体外反应体系所需液体量大、需特殊标记物或专用仪器等原因，并不适于PLA2抑制剂的高通量筛选。我们以PLA2催化水解7-Hydroxycoumarinyl-arachidonate为基础，测定在355ex/460em波长下的荧光读值，间接反应酶的活性。采用荧光法建立了一个高通量PLA2抑制剂体外药物筛选模型，并对酶浓度、反应时间与水解产物的生成量的关系进行了考察，表明两者与F值均呈良好的线性关系。本研究用二乙烯三胺五乙酸作为阳性对照，在本模型上显示较好的量效依赖关系，IC50值低于已报导的抑制剂，说明了该筛选模型的灵敏度。Z因子（0.87）以及高信噪比（S/B5）说明该模型具有较高稳定性。可高通量应用于筛选。参考文献1 Heller A, Koch T, Schmeck J,et al. Lipid mediators in inflammatory disordersJ.Drugs,1998,55(5):487-496.2 王兴勇，李晓文，卢仲毅，等。磷脂酶A 2激活在鼠急性食品与药品2007，9（7）543 Vadas P,PruzanskiW.Role of secretory phospholipase A2 in the pathobiology of disease J.Lab Invest,1986,55(4):391-404.4 Zheng Huang et al. A Continuous Fluorescence-based Assay for the Human High-Molecular-Weight Cytosolic Phospholipase A2.1994,222:110-1155 Lee EB,Kim SY.Anti-inflammatory compounds from platycodon grandiflorum root 3rd intemational symposium of recent advances in natural products research and 1999 Korea-Japan joint symposium,1999:108-116.6 郑智慧，任晓等。白细胞弹性蛋白酶抑制剂筛选模型的建立及抑制剂F02ZA-2554A的研究. 2007，32（5）:273-2767 Zhang, J.H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K.R. (1999). A simple statistical paremeter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4:6773.8 陈思峰，吴中立。体液和组织磷脂酶A2简便快速测定法J.第二军医大学学报，1989，10(3):254-2569 Yao Y, WangM H, Zhao K Y,et al. Assay for enzyme activity by following the absorbance change of pH-indicatorsJ. J.Biochem.Biophys. Methods,1998,36 (2-3):119-130.10 Lasch J, Willhardt I,