实验四 酵母分批培养实验2011.doc

实验四 酵母分批培养实验一、目的1. 掌握微生物分批培养的生物反应器操作；2. 掌握的菌体浓度、总糖等参数测定方法；3. 掌握分批培养的生长动力学及生长曲线的测定方法。4. 了解酵母的生长特性。二、原理 分批反应操作是指基质灭菌、接种以后，除了好氧反应需要在反应过程中通入无菌空气、消除泡沫所用的消泡剂以及维持一定pH值所用酸碱之外，反应过程中不再加入反应基质。基质浓度、产物浓度以及细胞浓度均随反应进行的时间而变化，尤其是菌体本身将经历不同的生长阶段（在培养的过程中，微生物的生长可分为迟缓期、对数生长期、减速期、静止期），显示出不同的催化活力。基本特征是：反应物料一次加入一次卸出；反应器物系的组成仅随时间而变化，即随着培养的进行，基质的浓度下降，菌体量增加，产物增加。因此它属于一非稳态过程。分批操作的工艺流程构成如图1三、主要试剂与设备 酵母、培养基、碱性酒石酸铜、0.05N NaOH 1mg/ml葡萄糖标准溶液等GUJS-100 机械搅拌式反应器、pH计、离心机、分光光度计等四、步骤（一）准备工作 空气源的检查主要检查供气压力、相对湿度是否正常；供气压力应在0.30.6MPa之间，相对湿度应于60%。 管道、阀门的检查检查管道、阀门是否有泄漏。如有泄漏,应进行调整，至无泄漏为止。 电气仪表的检查 检查发酵罐温度显示是否准确; 校检压力表、空气减压阀。 4. 发酵罐组装连接好冷却水管。若采用自来水冷却，要考虑到白天与夜间水压的变化，尽可能采用耐压管，连接部要充分牢固，并且注意连接管管径与自来水管管径应一致。由于通的空气有一定压力，应注意连接压缩空气的管子应能承受一定压力。安装pH及溶解氧等检测装置，注意各接线口不要出现差错。由于操作过程要和水打交道，故线路连接一定要注意安全，要特别注意防止漏电。5. 发酵装置(罐)的清洗 发酵罐使用前后都应认真清洗，特别是前后两次培养采用不同的菌株时，更应注意清洗和杀菌工作。 发酵罐有多种型式，罐内(可进行清洗的)任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂菌的滋生地。一般认为，发酵前期引起杂染菌的主要原因是由于清洗不净。易被忽略而未能充分清洗的地方有喷嘴内部与取样管内以及罐顶等处。另外，还应充分注意发酵罐周围的附件设备，如加热器、电机等的安全使用。6. 电极的标定 对pH电极和溶氧电极进行零点校正和斜率校正。7. 参数的控制及设定 根据发酵要求在操作面板或反应器应用程序上进行设定。发酵控制参数值如下： 温度30 时间48h, 空气流量 转速 80-100r/min 8. 种子培养液体试管培养：自斜面菌种挑取一环酵母菌体，接入装有10ml 10-12Bx无菌麦芽汁的液体试管中。摇匀，置于30培养箱24h. 三角瓶装培养：将上述培养好的液体试管种子接入250m1三角瓶的灭过菌的100 10-12Bx的麦芽汁，接种量10%， 30培养箱15-20h.9. 培养基的配置按配方配置发酵罐。培养基的体积通常为罐容积的50-60%。准确称量培养基各组分，溶解。一般配置培养基的体积为预定的70%，因为灭菌时，通入的蒸汽发生冷凝，会使发酵液的体积增加。使用合成培养基时，将糖类及磷酸盐溶液分别用高压灭菌锅灭菌，开始培养前放入发酵罐内，这是为了避免灭菌时糖类物质与氨基化合物反应生成褐色物质，以及防止磷酸盐与其它金属离子生成沉淀。 （二）发酵罐发酵步骤如下： 清洗空消实消冷却接种发酵取样放罐1. 蒸汽的产生打开蒸汽发生器进水阀和放气阀，加水至水位上限，关闭进水阀和放气阀。启动蒸汽发生器电源开关加热至0.40MPa左右。2. 空消空气过滤系统只空消，不实消，以免实消罐中物料冲入过滤器内；通蒸汽前检反应器所有阀门是否关闭。（1）空气过滤器及空气管路的消毒 关闭空气阀进入总阀、蒸汽阀进入空气过滤器阀；打开排冷凝水的阀门，慢慢打开净化蒸汽阀门，排尽冷凝水后阀门调为微开。进蒸汽顺着蒸汽管路开阀门，蒸汽为活汽。注意: 此时过滤器上部压力应在0.110.12MPa之间；压力过低将造成灭菌不彻底，压力过高则空气过滤器滤芯有可能被损坏而失去过滤能力。关闭进罐阀，微开相其邻的冷凝水的阀门 。开启空气压缩机, 调节空气减压阀, 使其出口压力在0.20.25MPa之间。消毒时间一般为30min。灭菌结束时，逆着进路关阀门。空气过滤系统先关主阀后关冷凝阀，再关净化蒸汽阀门 。 打开空气进入总阀、再依次顺管路开尾阀；排去冷凝水后,再将顺空气来路的先俩尾阀转为微开；稍开顺空气来路的第三阀保持空气流量在（0.4 0.5VVM），吹空气过滤器。 吹干空气过滤器一般需20min 左右。然后关闭依次关闭尾阀 ,保持空气管道及空气过滤器中是正压。 （2）罐体空消进蒸汽顺着蒸汽管路开阀门，蒸汽为活汽。蒸汽分二路进罐，先主管道，后次管道；蒸汽也按以上规则顺行进路径开阀，先开支路阀，再开排汽阀，最后为进罐阀。夹套排水: 打开进夹套蒸汽阀、排水阀夹套 ,排尽夹套中的水后即关闭蒸汽阀。顺序打开罐底部进蒸汽阀、尾阀， 排尽蒸汽管中冷凝水后将尾阀转为微开；稍开进罐阀,使蒸汽通过出料管进入发酵罐； 打开罐上部蒸汽阀 ，微开尾阀，稍开进罐阀，使蒸汽通过空气管进入发酵罐内； 微开灌顶出气阀对发酵罐进行空消。 注意在升温过程中需将“加热”、“冷却”、“pH调节”、“消泡”、“流加”开关置于“关”的位置或将控制器置与“停机”状态。 否则当温度设定值设定在培养温度时, 会自动通冷却水, 影响升温速度,同时也浪费蒸汽。 在灭菌过程中,应时刻注意罐压, 并控制在0.110.12MPa之内,请勿超压。罐压升至0.12MPa(此时控制系统中温度读数约为120左右)时开始计时，灭菌30min。灭菌时，保持各阀排气通畅，防止存在死角。保压方式：a. 调节主汽路进汽阀门控制进汽量；b. 调节空气排气口阀门大小或出汽阀大小。 空消时间一般为3050 min。灭菌结束时，逆着进路关阀门。空气过滤系统先关主阀后关尾阀，完成；进罐蒸汽管路先关进汽阀，再排汽阀，最后为支路阀。空消一结束，即要通入无菌空气吹干空气过滤系统管路并保压，避免染菌。 使罐压保持在0.030.05MPa之间。 当罐温降至80以下时方可打开罐底进罐阀、尾阀、,排尽发酵罐内的冷凝水后即关闭关闭阀门。(打开罐顶排汽阀直至表压为零，再通过罐底排空罐里的冷凝水)3. 实消 打开排气阀，关闭罐上部进气阀, 卸去罐内压力；将校验好的pH、DO电极装入发酵罐内。 打开罐盖上的加料口，将培养基原液加入发酵罐内，并加水至所配培养液总量的7585%左右(视环境温度、蒸汽压力及接种量而定，其余2515%为蒸汽冷凝水和种子量)。拧紧加料口螺母(注意：不要拧得太紧，否则会损坏密封圈)。 进料完成后，向夹套中通入蒸汽将发酵液加热至80以上，关闭蒸汽阀门。随后向发酵液通入蒸汽至0.12MPa，保持30min。灭菌时，保持排气通畅，使罐内空气充分排出，同时使出口管内灭菌更充分。如果不预先加热夹套，会生成大量的冷凝水，导致发酵罐内发酵的培养基的体积很难控制。4. 冷却： 灭菌结束后，立即打开冷却水（下进上出）至30。5. 接种、发酵： 适当降低通风量，使高压接近零。在接种口（进料口）周围放置浸有酒精的棉花，点燃后迅速打开接种口，将菌种加入到发酵罐中，旋紧接种口盖子，熄灭火焰，调节通风量，接上玻璃转子流量计，使流量计读数在8.0左右，同时保持罐压0.04Mpa，保温保压发酵48hr6. 取样 培养基放入罐前取50ml，测定其还原糖，菌体量。发酵每隔4h后取样100 m测定菌体量、总还原糖。取样时，将取样口最初的10ml培养液弃掉。具体操作如下：（1） 须提前半小时，开启蒸汽发生器，送入蒸汽，开启阀门1，2，蒸汽灭菌。（2） 半小时后，关阀门1，立即开启阀门3，先放弃部分培养液，再取样100ml左右至灭菌三角瓶中（标注好取样日期、时间、取样人），冷藏备测。（3） 关闭阀门3，开启阀门1，半小时后关闭阀门2，再关阀门1。7. 放罐：培养完成时，除取出足够量的培养液作为样品外，剩余培养液要经过杀菌处理。此时发酵罐所装有的电极可一同经杀菌处理。如果培养液为无害物质，可将电极单独取出处理，以利于延长电极使用寿命。杀菌完成后，温度降低到一定温度时，取出电极，将杀菌后培养液丢弃到指定地点。一般培养液温度较高时，有难闻气味产生，因此，排放温度应尽可能低一些。 8. 清洗：空罐后，加大排气，使表压掉零，取出各探头，加盖，由进料口加入净水关好，罐内升压，放罐，如此重复两次。清洗、空消、实消、冷却操作完全一致； 五、记录、数据处理（一） 测定方法：1. 菌体浓度测定：将培养液适当稀释后，在660nm，波长下测其浊度，同时采用血球记数。 2. 还原糖测定方法：采用菲林法测定。 （二） 记录：数据采集：系统自动采集，每2min采集一组数据并存贮，包括：温度、溶氧、pH、等，系统可自动给出有关曲线。同时由值班者每30min记录一次，准确填表，获取数据制作过程曲线。值班人员做好记录，发酵罐每隔4h取样。按表1 记录。（三）以时间为横坐标，菌体浓度、 还原糖%、pH、OD为纵坐标作图，观察各参数的变化。采用计算机拟和对数生长期的动力学方程。（四）用图示表示比生长速率=(dX/ dt) /X、比消耗速率=（dS / dt）/ X等随时间变化趋势。表1 酵母发酵批报罐批 接种时间 放罐时间 取样时间培养时间pH罐温搅拌转速rpmOD通气量l/minDO菌体量mg/l还原糖%值班签名六、思考题：1. 空消时，应注意什么？2. 微生物接种一般接种方法有几种？3. 配置培养基应注意什么？附1：直接滴定法一、 实验原理样品加入盐酸后，糖类水解转化糖，再经除去蛋白质，在加热条件下，直接滴定标定过的碱性酒石酸铜液，以次甲基蓝作指示剂，根据样品液消耗体积，计算还原糖量。二、 试剂1、 碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜及0.05g次甲基蓝，溶于水中并稀释至1000ml。2、 碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000ml，贮存于橡胶塞玻璃瓶内。3、 乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3ml冰乙酸，加水溶解并稀释至100ml。4、 10.6%亚铁氰化钾溶液。5、 盐酸、6mol/L盐酸、20%氢氧化钠6、 葡萄糖标准溶液：精密称取1.000g经过98100干燥至恒量的纯葡萄糖，加水溶解后加入5ml盐酸，并以水稀释至1000ml。此溶液每毫升相当于1mg葡萄糖。三、 实验步骤1、 取100ml样品置于200ml容量瓶中，加入50ml水，摇匀后再加入6NHCl 10ml，在6870水浴中加热30min,冷却后加入两滴甲基红指示剂,用20%NaOH中和至中性,再加入5ml乙酸锌以及5ml10.6%亚铁氰化钾溶液，加水至刻度，混匀,静置30min,用三层纱布过滤，弃去初滤液，滤液备用。2、 标定碱性酒石酸铜溶液：吸取5.0ml碱性酒石酸铜甲液及5.0ml乙液，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠两粒，从滴定管加约9ml葡萄糖标准溶液，控制在2min内加热沸腾，趁沸腾以每两秒一滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积，同时平行操作三份，取其平均值，计算每10ml (甲、乙液各5ml) 碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量(mg)。3、 样品溶液预测：吸取5.0ml碱性酒石酸铜甲液及5.0ml乙液，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠两粒，控制在2min内加热至沸，趁沸以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品溶液，并保持溶液沸腾状态，待溶液颜色变浅时，以每两秒一滴的速度滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为