臭氧预处理对大麦秸秆的产氢的影响.doc

臭氧预处理对大麦秸秆的产氢的影响摘要：探讨了臭氧技术在麦秆木质纤维素生物产氢中的应用。臭氧预处理有效地降解秸秆木质素和还原糖产量增加。一个同时进行酶水解和厌氧生物发酵（暗发酵）（dark fermentation）的实验需要厌氧酶混合在糖化酶中一起使用。未处理和臭氧样品都能产氢。相比与对照组，由臭氧组产生的氢15，30，45和90分钟，分别增加了99，133，166和94。臭氧样品中观察到90分钟时，对产氢有一定的抑制作用，而且是由发酵微生物产生的抑制，而不是糖化酶。这些结果表明，从大麦稻草，木质纤维素生物质中生物制氢，臭氧预处理可以显着提高生物产氢量。关键字：生物产氢 臭氧预处理 大麦秸秆 木质素降解 厌氧生物发酵（暗发酵）1 引言生物产氢已经吸引了全世界的关注，因为氢是一种潜在的取之不尽，用之不竭，成本低，可再生的清洁能源(Ren et al., 2009)。有不同的生物产氢的方法，其中厌氧微生物发酵（黑发酵）是更有利的，因为产率高，过程简单和低价值的废物做进料的利用率(Guo et al., 2010; Hawkes et al., 2007; Ntaikou et al., 2010)。氢气和乙醇都可以通过发酵过程产生，然而，已经表明从生物质发酵中产氢比产乙醇更有优点。因为产生氢的微生物，可以使用更广泛的纤维素水解产物，和主要基于酵母产乙醇的微生物相比。(Nasirian et al., 2011; Hawkes et al., 2002). 此外，氢是高能量的，具有高能量的产率为122千焦/克，这是烃类燃料的2.75倍以上(Kapdan and Kargi, 2006; van Groenestijn et al., 2002). 事实上，近年来已报道越来越多的研究工作进一步致力于生物乙醇转化为氢。(Ni et al., 2007; Iulianellia and Basile, 2011). 现在被认为是最有前途的生物产氢，在进行一系列的燃料进化技术。(Das, 2009)。 在现有的微生物发酵产氢的的原料木质纤维素生物质是一个最有吸引力的，由于其低成本，广泛分布在世界各地。(Ren et al., 2009; Guo et al., 2010; Chong et al., 2009; Qumneur et al., 2012b; Ntaikou et al., 2010). 全球陆地植物和海洋藻类生物合成的纤维素的速率为30109吨每年，要超过世界每年能源消费总量的4倍。木质纤维素生物质产氢的研究进展，不仅能分开食品和生物燃料的生产，也能确保安全的能源供应可再生。 木质纤维素主要由纤维素，半纤维素和木质素构成;在木质纤维素里90%的成分都是干物质，和在木质纤维材料里形成复杂的高分子结构。在三种组要成分中（纤维素，半纤维素和木质素）生物制氢主要由纤维素和半纤维素生产。为了发酵氢，纤维素和半纤维素首先水解成糖; 糖可以用作微生物的底物，并且可以在微生物发酵过程中转化为氢气。However, both cellulose and hemicellulose are rigidly covered by lignin, and lignin hinders cellulose andhemicellulose from enzymatic hydrolysis。为了从木质纤维素生物质中达到高效的生物产氢，一个预处理过程通常是进行的。预处理的目的是去除木质素，以及改变结构和组成上的障碍，以提高消化率和提高酶的水解率，让更多的纤维素和半纤维素的水解成降解糖；产糖量越高，产氢量就越高。多样化的预处理技术已用于从木质纤维原料生产乙醇，包括物理，化学和生物的方法，以及臭氧应用在这些预处理中。臭氧是一种强氧化剂，可以有效地降解木质素和半纤维素的一部分。然而，到目前为止臭氧技术没有被应用到木质纤维素生物制氢生产中。臭氧处理是一个有吸引力的预处理方法，因为它在处理后不会留酸性，碱性或有毒残留物；此外，臭氧化反应是在室温和常压下进行的。尽管事实上臭氧本身不会留下任何有毒残留物，然而，目前还不清楚是否能通过臭氧降解木质素；臭氧这个强氧化剂，有可能产生的任何产品，会抑制随后酶水解或微生物发酵，或者两者兼而有之。由于到目前为止，还没有研究臭氧预处理大麦秸秆，木质纤维素生物质，产氢的报道，因此，对此事进行调查，目的是探索臭氧技术应用到木质纤维素生物制氢。2 实验方法2.1大麦秸秆大麦秸秆取自棚户湾，加拿大安大略湖的一个农场，收到秸秆是干燥 ，切割机瑞驰切割机，型号为SM100。切割的稻草，然后通过2毫米筛，并存储在室温下在密封的塑料袋中，直到所使用。2.2 臭氧预处理臭氧化是在一个350毫升的洗气瓶中进行半间歇反应器。冲洗瓶的气体扩散器的直径为60毫米，扩散器孔的大小为40-60流明（lm光通量的单位。发光强度为1坎德拉(cd)的点光源，在单位立体角（1球面度）内发出的光通量为“1流明”）。在型号为GL-1臭氧发生器中由纯氧产生臭氧。安装臭氧监测仪（型号HC-400），目的是测量臭氧发生器的输出气体中臭氧的浓度。臭氧剂量的应用可以很容易地通过改变臭氧的百分比（重量）和/或气体流量调整臭氧量。别处还有关于实验装置的更多细节描述。 对于每个实验，都要有平行的三个洗涤瓶反应器。臭氧化开始时的臭氧 - 氧气混合物从底部送入反应器。每个反应器含有5克（干重）与水混合后研磨的大麦秸秆，达到40的水含量。进料气体在恒定压力为75.84千帕，恒定流速为0.63 SLPM的条件下连续运行。臭氧是由喷射纯氧到反应器中而结束，而不是臭氧和氧气的混合。臭氧预处理后，每个样品（5克）被分为3个部分：1克的用于木质素含量的分析， 2克用于暗发酵实验，而其余的用于酶水解测定还原糖含量。2.3酶水解 用到的酶有NS22086，NS22083和NS22118，全部由诺维信（丹麦诺维信公司（Novozymes A/S）成立于1941年,是领导世界酶制剂和微生物领域产品的公司）提供。NS22086是用于木质纤维素材料水解的纤维素复合酶，它催化纤维素材料分解成葡萄糖，纤维二糖和更高的葡萄糖聚合物；NS22083是用于补充未受NS22086影响水解的半纤维素的木聚糖内切酶; NS22118是一种-葡萄糖苷酶，用于补充NS22086水解纤维二糖，葡萄糖。酶水解进行两个实验：(i)：暗发酵（厌氧生物发酵） (ii)：酶水解。在这两个实验中NS22086，NS22083和NS22118的用量分别为5，0.2和0.6。在厌氧生物发酵中和酶混合加入的还有大麦秸杆，营养液和菌剂，因此，糖化作用和发酵作用是同时进行的。而酶水解实验是一个单独的实验中，在本实验中没有微生物的接种物，也没有营养液的添加。水解实验的目的是要估量有和没有臭氧预处理的还原糖含量。酶水解在40毫升的螺丝帽小瓶中。每个小瓶收到臭氧或未经处理的大麦秸秆相当于0.2克（干重）。将秸秆放入小瓶之后，加入蒸馏水至总体积为10毫升，将pH值调节4.8。然后加入含有所需量的酶和0.04叠氮化钠（以防止微生物的生长）的柠檬酸盐缓冲液（10毫升0.1M的pH值为4.8）。因此，最终在每个小瓶中为20ml的0.05M的pH为4.8的柠檬酸盐缓冲液，含有0.2克（干重）的秸秆，所需量的酶，和0.02叠氮化钠。，然后紧紧地盖紧小瓶与螺丝帽，并培养在50每分钟120转的旋转摇床（型号伊诺40，新不伦瑞克科学，恩菲尔德，CT，美国）。样品分别在72，120和168小时，测量还原糖的量。2.4 发酵实验分批发酵实验安装使用160毫升的血清瓶作为实验容器。每瓶中的臭氧或未经处理的的大麦秸秆相当于2.0克（干重）。每个瓶中然后加入蒸馏水至总体积为40ml，将pH值调节到6.0以下；然后加入：1.5毫升培养液，pH为6.0的营养液37.5毫升，1毫升的酶混合物（包含所需的酶）。每个瓶子的体积和营养液的pH分别为80毫升，pH值6.0。这些瓶子然后用氮气冲洗5分钟，以驱除氧；丁基橡胶瓶塞和铝卷缩上限，并培养在35的黑暗中旋转摇床60转。所有实验组分别设置一式三份。用于本实验的接种物混合物是牛粪和池塘沉积物，是在加拿大安大略省马克姆，从当地的奶牛场取的样。粪便和沉积物混合以1:1:1（粪：沉积物：水）的比例，使之形成悬浮液，然后彻底混匀，并在90加热20分钟，之后被用作接种物。 养分在下列最终浓度（毫克/升）：NH4Cl 530; KHPO4 450; K2HPO4 80; CaCl2_2H2O 60; MgSO4_7H2-O 160; FeCl2_4H2O 20; NiCl2_6H2O 60; Na2MoO4_2H2O 180酵母提取物200。除了这些营养素，某些微量元素的储备液加入在0.1（体积/体积）中，微量元素原液配方如下（毫克/升）：MnCl2-_4H2O 500; CuCl2 25; ZnCl2 50; H3BO3 50; CoCl2_6H2O 500; Na2-SeO3 30。2.5分析方法 NREL(国家能源实验室)实验室分析测定酸不溶性的木质素程序（LAP）“结构性碳水化合物和木质素生物测定。采用改良的DNS法测定还原糖。为了测量还原糖，1.5毫升等分试样的水解产物以3000rpm的转速离心5分钟，然后将上清液通过0.2-lm的过滤器过滤，用于测量。使用量气管测量酸化水位移的方法来确定产生的气体量。使用气相色谱仪（Perkin Elmer公司于AutoSystem XL）配备有热导检测器（TCD）分析样品的顶部气体。气相色谱分析所用的柱是的HayeSep DB，3001/800的不锈钢柱（奥特奇），用氮气作为载气，流速为26升/分钟。喷油器，检测器和色谱柱的温度分别为70，180和60。3 结果与讨论3.1臭氧剂量对降解木质素的影响 第一个实验中所应用的臭氧剂量实验。从不同的臭氧剂量中试图选择一个做适当的后续实验。臭氧作用时间，流速，试样尺寸和样品的含水量都是臭氧脱木质素的影响因素；在这个实验中，他们被固定在45分钟，0.63 SLPM，2毫米，和40，分别为。结果绘于图1中，如该图所示1，臭氧有效降解麦秸木质素，并与所施加的臭氧剂量增加的脱木素。未经处理的样品含有20.7（重量的干重）的木质素，经过臭氧1.65毫克O3/克稻草？木质素含量下降至16.2。随着臭氧剂量增加至3.29毫克的臭氧/克秸秆分钟，木质素含量下降至14.2; 当臭氧剂量增加至6.58毫克的臭氧/克稻草？分钟，木质素含量进一步下降至12.4。(Fig. 1).臭氧是高度反应结合高电子密度的共轭双键官能团的化合物，尽管木质素是许多方法顽抗，它具有高含量的C=C键，因此，可以有效地被臭氧降解。正如上面所提到的，木质素包围着纤维素和半纤维素的分子，使得他们很难达到，因此，木质素的含量和分布，构成了最被认可的因素负责顽抗木质纤维材料，酶和微生物的降解。在图1中所示，大麦秸秆木质素有效地被臭氧氧化降解，表明臭氧化可能是潜在的预处理选项，以提高木质纤维素生物质的生物产氢量。绘制在图1，进一步增加了臭氧剂量从4.94至6.58毫克的臭氧/克稻草？敏，并没有显着提高木质素的降解。因此，4.94毫克O3/克稻草？敏被选为臭氧剂量应用的后续实验。如图1所示。影响大麦秸秆的木质素含量。应用臭氧剂量 0剂量是未经处理的样品（对照组），结果表示为平均值重复样本的标准误差。3.2 臭氧化作用时间的影响 在这个实验中的气体流率，样品水分和样本大小保持相同臭氧剂量上述实验中使用的，和4.94的O3毫克/克稻草作为所加的臭氧剂量，结果示于图2。 木质素含量随臭氧化时间的增加而降低（图2）。臭氧化15分钟后，木质素含量从20.7降低到15.4; 当臭氧化时间增一倍至30分钟，另外1.8的木质素降解剩下13.6的木质素。当臭氧化时间增加至45，60和90分钟，木质素含量进一步分别下降至13.1，12.4和12.1。长时间臭氧化150分钟没有明显降解木质素（图2），这表明，在我们的实验条件下，容易被臭氧化的木质素降解在90分钟之内。图2。大麦秸秆木质素含量的臭氧时间的影响。0分钟是未经处理的样品（对照组）的结果表示为一式三份样品的平均值标准误差。3.3 生物产氢臭氧降解木质素，因此，合乎逻辑的预期臭氧预处理将提高产氢量。然而，尽管事实上，臭氧本身不产生任何有毒残留物，但是已报道臭氧脱木素过程中可能会产生一些有毒的产品可以抑制随后的酶促水解或微生物发酵，或两者都可能发生。例如，在臭氧氧化处理的是一些不溶性的木质素降解成可溶产物，和可溶性木质素，由于木质纤维素的预处理，是一种抑制纤维素酶，木聚糖酶，和葡萄糖苷酶的活动。同样地，直接抑制发酵微生物的生长和代谢也有报道。似乎木质素降解的提高不一定会增加产氢，因此，必要的，进行暗发酵实验，以确定臭氧预处理对大麦秸秆生物产氢的整体效果。3.3.1臭氧化对生物产氢量的影响 分批发酵实验进行研究臭氧对生物制氢生产的影响，臭氧为15，30，45和90分钟，以及未处理（对照样品）进行实验. 未处理的和臭氧化的样品（图3）生成的氢，没有检测到甲烷，表示没有产甲烷菌。在图3中所示，臭氧预处理显着增加产氢. 经过7天的潜伏期，对照组产生70.1毫升氢气，而臭氧组15，30，45和90分钟产量为139.2，163.5，186.8和氢135.8毫升。相比于对照组，15，30，45和90分钟的臭氧化的基团产生的氢分别增加了99，133，166和94。观察臭氧样品90分钟时会产生一定的抑制作用。即使这组的臭氧化时间最长，然而，7天的潜伏期后，本组生产的氢比30分钟 - 45分钟产生的氢少。事实上，在臭氧化组，第一天和第三天，90分钟时产生的氢量最少；3天之后，该小组中的产氢被改善，因此，在第5天和第7天的总的氢比得上15分钟产生的氢，但仍小于30 - 和45分钟的组所产生的氢。图3中。累积的氢所产生的未经处理的样品（0分钟）和15，30，45，和90分钟的臭氧的样品的结果表示为一式三份样品的平均值标准误差 这抑制作用也就是CO2的结果。类似H2结果，在7天的潜伏期后，90分钟所产生的二氧化碳总量小于组30和45分钟的。图4还表明，不管怎样的处理，所有的组产生H2：CO2的比约是（1.44-1.53），表明两种气体的抑制效果是非选择的。目前有不同的预处理方法，包括物理，化学，热和生物的方法，然而，所有这些现有的预处理工艺都不希望产生的副产物抑制发酵过程。据报道，这些抑制剂主要由三个组分构成：弱酸，呋喃衍生物，酚类化合物，如醋酸半纤维素降解生成来自降解木质素酚醛树脂单体等。这些抑制微生物的生长和代谢有不同的行动模式：未解离的弱有机酸穿透微生物细胞，降低细胞内pH值;糠醛衍生物干扰发酵酶，而酚类化合物破坏微生物细胞膜. 例如，Qumneur等（2012B）生产氢气以及对细菌群落和新陈代谢，纤维素衍生的化合物（即呋喃衍生物，酚类化合物和木质素）的影响进行评估，并认为所有的抑制化合物表现出显着的负面影响H2生产的性能。这些预处理选项类似，本研究的结果也表明，臭氧处理也可能会产生抑制剂; 然而，发酵试验的结果明确地显示，在我们的实验条件下，整体净效应是显着增加生物制氢。7天的潜伏期后产生的气体累积未处理臭氧为15，30，45，和90分钟的样品（0分钟）和样品。结果是表达为一式三份样品的平均值标准误差。3.3.2。臭氧对糖产量的影响尽管观察到一定的抑制作用，然而，因为在本研究的生物产氢的同时发生糖化和发酵过程，难以区分抑制作用是否针对酶或微生物，或两者兼而有之。因此，单独进行水解实验，以提供更多的洞察的抑制作用。酶水解的结果列于图5。如图所示5，臭氧预处理显著提高从大麦秸秆中还原糖产量。水解后，未处理样品的还原糖产率是162毫克/克稻草，相反，15,30，45和90分钟的臭氧样品还原糖产量分别为345，474，542和608毫克/克稻草。与未处理的样品相比，15，30，45和90分钟的臭氧预处理糖产量增加113，193，234和275。 要显示糖产量和木质素降解之间的关系，除去木质素的结果也绘制在图5。这些结果是从图转换 2(木质素降解)。图5清楚地表明，随着木质素的除去水解产物中的还原糖的量增加。这些结果与文献报道一致。例如，加西亚Cubero的等（2010）报道，臭