液相色谱-串联质谱法同时测定猪尿中的22种违禁药物20121208.doc

液相色谱串联质谱法同时测定猪尿中的22种违禁药物王旭峰 张高奎 杨建文 卞愧 王宗楠 王立琦 张桂君 贺利民*（华南农业大学兽医学院兽医药理研究室，广州 510642）摘要 建立了液相色谱串联电喷雾质谱同时测定猪尿液中22种违禁药物的分析方法。猪尿样真空冷冻干燥处理，用10%甲醇水（0.1%甲酸）溶液复溶， Anpel MCX固相萃取小柱净化、富集。以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，经CNW Athena C-18色谱柱（150 mm2.1 mm, 5 mm）分离，采用电喷雾电离，多反应监测正离子模式对22种药物进行定性和定量分析。采用基质匹配标准溶液校正，各个药物的响应与其质量浓度在0.5100 mg/L范围内呈良好的线性关系, 相关系数(r)大于0.99；以3倍信噪比(S/N)和10倍S/N计算方法检出限和定量限，分别为0.54 mg/L和110 mg/L；在LOQ、10、20及50 mg/L四个添加水平，猪尿中22种药物的平均回收率为50.2%97.7%；日内相对标准偏差（RSD）和日间RSD分别为1.0%8.6%和4.7%17.9%。实验结果表明，该方法简单、灵敏、可靠，适用于猪尿-受体激动剂类、激素类、硝基咪唑类和镇定类等22种违禁药物残留的确证分析。关键词 液相色谱-串联质谱；违禁药物；多残留检测；猪尿1 引 言在畜牧业生产中兽药、促生长剂的使用日益频繁，动物性食品中的兽药残留和食品安全问题成为消费者关注的焦点1。我国农业部2002年底颁布的235号公告2中明确规定禁止用于食品动物的药物31种（包括克伦特罗等-受体激动剂类、激素类、硝基呋喃类、硝基咪唑类和镇定类等），限制使用（允许作治疗用，不得在动物食品中检出）的药物9种（氯丙嗪、赛拉嗪、安定、地美硝唑、甲硝唑、苯甲酸雌二醇、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮及潮霉素B）。目前，对这些违禁药物在动物食品中残留的分析检测和筛查需要采用数种分析方法36，既缺乏时效性也浪费大量人力、物力和财力。开展动物食品中违禁药物的高通量分析筛查方法研究具有重要意义。国外采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析检测动物食品79及环境水、土壤10,11中的多类药物残留检测的报道较多；国内，有采用LC-MS/MS分析检测畜禽肉、牛奶基质中3类20种兽药的检测和猪肉、猪肝、虾、牛奶和鸡蛋中6类76种兽药残留同时测定的报道12,13，但关于其它食品基质、饲料及尿液中多残留检测的报道较少。本研究针对我国动物食品中违禁药物残留监测被动的局面，开展采用LC-MS/MS进行高通量禁用药物筛查，建立了猪尿中建立了猪尿中-受体激动剂（西马特罗、沙丁胺醇、克伦特罗）、硝基咪唑类药物（甲硝唑、地美硝唑、洛硝达唑）、农药（双甲脒、克百威）、镇定类药物（赛拉嗪、氯丙嗪、安眠酮、地西泮）、激素类药物（群勃龙、诺龙、甲睾酮、丙酸诺龙、丙酸睾酮、醋酸甲孕酮）、孔雀石绿、隐形孔雀石绿、硝呋烯腙、氨苯砜等22违禁农兽药的多类多残留分析检测方法。方法简单、灵敏、可靠，各项技术指标满足实际样品中禁用药物残留检测要求。2 实验部分2.1 仪器与试剂Agilent 1200 高效液相色谱系统（安捷伦公司）；API 4000 电喷雾-串联四级杆质谱仪（应用生物系统公司）；氮气吹干仪（美国Zymark公司）；固相萃取仪（Waters公司）；真空冷冻干燥机（德国Thyracont Elektronic GmbH）。对照品（纯度99%，中国兽医药品监察所，Sigma公司及Dr. Ehrenstorfer GmbH），甲醇、乙腈、甲酸及乙酸铵（色谱纯，美国Fisher Scientific公司），其它试剂为分析纯。猪尿试样由农业部畜禽产品质量监督检验测试中心(广州)提供，处理前于-20冷冻保存。2.2 实验方法2.2.1 猪尿样品前处理 量取1 mL猪尿试样置于10 mL离心管中，-20冷冻1 h，转移至-80条件下真空冷冻干燥8 h，残渣加入5 mL 10%甲醇水（含0.1%甲酸）溶液，超声5 min溶解，离心后净化。用甲醇活化Anpel MCX SPE小柱，3 mL水和2%甲酸水溶液平衡。将5 mL复溶液全部过柱，依次用2%甲酸水溶液和10%甲醇水溶液淋洗，抽干后用3 mL 5%氨化甲醇洗脱。洗脱液于40水浴中吹干，加1 mL 10%甲醇水（含0.1%甲酸及10 mmol/L乙酸铵）溶液超声溶解，过0.22 mm滤膜，上机检测。2.2.2 基质匹配标准工作液 各对照品储备液用甲醇稀释，配制成10 mg/mL的中间混和标准溶液，再用10%甲醇水（含0.1%甲酸及10mmol/L乙酸铵）溶液稀释成5，10，20，50，100，200，500和1000 mg/L的系列混合标准溶液。取100 mL上述系列浓度的标准溶液与按2 2 1方法处理的空白猪尿液900 mL涡旋，混匀，制得0.5，1，2，5，10，20，50和100 mg/L的基质匹配标准工作液。2.3 色谱-质谱条件流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。色谱柱：CNW Athena C18色谱柱（150 mm2.1 mm i.d., 5 mm）。梯度洗脱条件：08 min，95%45% A；811 min，45%5% A；1115 min，5% A；1516 min，5%95% A；1623 min，95% A。进样量：10 mL，流速：0.25 mL/min。电喷雾离子源（ESI）：正离子扫描，多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压（IS）：4 kV;离子源温度：650；碰撞室压力（CAD）：27.5 kPa；气帘气压力（CUR）：137.9 kPa；雾化气压力（GS1）：379.2 kPa；辅助气压力（GS2）：413.7 kPa；滞留时间：150 ms。表 1 22种药物的MRM质谱优化参数Table 1 Optimized MRM mass parameters for 22 analytes化合物Compound保留时间Retention timetR (min)去簇电压Declustering potential(eV)定量离子Quantification transition（碰撞能量Collision energy, eV）定性离子Qualification transition（碰撞能量Collision energy, eV）离子丰度比Abundance ratio of ions纯溶剂 Solvent猪尿Matrix西马特罗Cimaterol4.0155220.2202.0 (16)220.2143.2 (14)0.280.31沙丁胺醇Salbutamol4.3360240.0148.0 (24)240.0221.9 (23)0.200.21克仑特罗Clenbuterol10.3548277.1203.0 (23)277.1259.0 (16)0.220.23甲硝唑Metronidazole6.8954142.096.2 (25)142.081.1 (35)0.180.21地美硝唑Dimetridazole5.7060172.1128.0 (19)172.182.0 (38)0.370.39洛硝达唑Ronidazole8.3640201.0140.0 (40)201.0110.2 (18)0.560.52硝呋烯腙Difurazone12.769361.2 221.1 (26)361.2180.1 (30)0.790.84双甲脒Chlordimeform10.5670197.2117.1 (40)197.2152.1 (25)0.440.41克百威Carbofunan14.6643222.2 165.2 (18)222.2123.1 (31)0.340.36赛拉嗪Xylazine 10.7776221.3 90.1 (30)221.3 164.0(35)0.290.31氨苯砜Dapsone11.3280249.2 156.1 (20)249.2 108.1(36)0.650.63安眠酮Methaqualone15.1590251.2132.1(36)251.291.2(60)0.100.11地西泮Diazepam16.3260285.1154.1 (38)285.1222.2 (38)0.180.19氯丙嗪Clorpromazine13.3880318.9 86.1 (30)318.9 247.1 (30)0.400.42群勃龙Trenbolone15.40130271.3 199.2 (35)271.3253.3 (28)0.360.38诺龙Nandrolone15.6396275.4109.1 (36)275.4257.4 (24)0.810.86丙酸诺龙 Nandrolone propionate18.77102331.3 109.2 (33)331.3 275.4 27)0.380.40甲睾酮 Methyl testosterone16.7390303.397.2 (37)303.3109.1 (37)0.170.13丙酸睾酮 Testosterone propionate19.03113345.3 109.1 (39)345.3285.4 (25)0.120.11醋酸甲孕酮 Mengestrol acetate17.7664385.4224.2 (35)385.4267.2 (26)0.880.86孔雀石绿 Malachite green13.98100329.2313.1 (40)329.2208.1 (38)0.320.28隐形孔雀石绿Leucomalachite green14.76100331.4239.1(36)331.4316.1 (20)0.920.913 结果与讨论3.1仪器条件优化3.1.1 质谱条件选择 按照EC第657/2002/EC决议的规定，根据每种化合物的准分子离子及其特征子离子的质谱图，选择两个子离子与母离子组成两对离子对进行MRM监测。先对每个药物（110 mg/mL）进行全扫描，确定每种药物的母离子和子离子，再依次对子离子和碰撞能进行优化，从中选择两个相对丰度较高，干扰较少的子离子作为定性离子和定量离子。与液相色谱连接，进一步优化每个药物的碰撞能量、去簇电压、滞留时间等质谱参数，建立MRM模式下各种药物的质谱采集参数（见表1）。3.1.2 色谱柱和流动相的选择 考察了Thermo Hybrid Golden C18, CNW Athena C18-WP及Phenomenex Luna C18（150 mm 2.1 mm i.d., 5 mm）三种色谱柱和10 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）、0.1%甲酸-乙腈及0.1%甲酸-甲醇三种流动相体系对22种药物的分离效果。实验表明，CNW Athena C18-WP色谱柱在0.1%甲酸-乙腈体系，22种检测药物分离良好，峰形对称尖锐（见图1，2），其它条件下都难以实现22种分析物良好分离和获得对称的峰形。图 1 10种药物标准溶液的总离子流色谱图（10 mg/L）Fig.1 Ionic chromatograms of 10 compounds in solvent standard at 10 mg/L图 2 12种药物标准溶液的总离子流色谱图（10 mg/L）Fig.2 Ionic chromatograms of 12 compounds in solvent standard at 10 mg/L3.2样品前处理3.2.1 提取 考虑22个目标分析物包括多类、多种违禁药物，它们的理化性质差异大，所以本研究采用直接将猪尿液真空冷冻干燥，选择合适溶剂复溶、离心去除部分不溶杂质，再用固相萃取小柱净化。该法避免了使用液-液萃取时，因没有合适的提取溶剂而部分药物回收率低的问题。实验比较了2%甲酸水和10%甲醇水（含0.1%甲酸）溶液作为复溶液，结果表明，10%甲醇水（含0.1%甲酸）溶液能很好的溶解冻干残渣中的药物，作为固相萃取小柱的上样溶液，大部分药物都能够很好的保留。3.2.2 净化 因目标分析物极性差异较大，而大部分药物具有弱碱性，所以选择由非极性的C18和阳离子交换作用组成的混合型小柱进行富集净化。实验比较了Strata-X-C和Anpel两种混合型阳离子交换小柱的效果，二者在回收率和净化效果方面差异不大，从经济角度考虑，本实验选择Anpel MCX小柱净化冻干猪尿试样。复溶后的猪尿液通过MCX小柱后，依次用3 mL 2%甲酸水溶液和甲醇淋洗小柱，除去基质中的干扰成分。但甲醇淋洗液时发现激素类药物中的群勃龙、诺龙、丙酸诺龙、甲睾酮和丙酸睾酮分别洗脱达96.8%、91.7%、62.7%、95.0%和51.6%，用10%甲醇水溶液代替甲醇淋洗，可在除去干扰杂质的同时保证药物在小柱上的稳定保留。用同等体积氨化甲醇或乙腈洗脱药物，乙腈未能完全洗脱所有分析物，最终选择5%的氨化甲醇3 mL作为洗脱液。3.3线性范围和灵敏度以定量离子峰面积Y为纵坐标，药物浓度x（mg/L）为横坐标进行线性回归分析。在0.5100 mg/L浓度范围内，各个药物基质匹配标准曲线线性关系均良好（r0.99），按3倍信噪比（S/N）计算检出限（LOD），10倍S/N计算定量限（LOQ），西马特罗、沙丁胺醇、克伦特罗、赛拉嗪、氯丙嗪、地西泮、氨苯砜、甲睾酮及醋酸甲孕酮的LOD及LOQ分别为0.5和1 mg/L，甲硝唑、地美硝唑及硝呋烯腙分别为1和2 mg/L，双甲脒、克百威、安眠酮、诺龙、丙酸诺龙、丙酸睾酮、孔雀石绿及隐形孔雀石绿分别为2和5 mg/L，洛硝达唑及群勃龙分别为4和10 mg/L。3.4回收率和精密度 空白猪尿分别添加LOQ，10，20和50 mg/L的混合标准溶液，并设空白对照，每个浓度做5次平行，按照2 2 1方法处理，重复3天。四个添加浓度水平，22种药物平均回收率为50.2%97.7%。日内相对标准偏差和日间相对标准偏差分别为1.0%8.6%和4.7%17.9%，结果见表 3。表 2 回收率和精密度（n= 5）Table 2 Recoveries and precisions（n= 5）化合物Compound回收率Recoveries (%)日内相对标准偏差Intra-day RSD (%)日间相对标准偏差Inter-day RSD (%)添加浓度 (Spiked concentration levels, mg/L)LOQ102050LOQ102050西马特罗Cimaterol86.092.194.788.73.84.11.94.27.6沙丁胺醇Salbutamol89.194.896.195.52.93.11.75.68.7克仑特罗Clenbuterol90.397.791.292.34.62.13.86.39.6甲硝唑Metronidazole68.470.970.069.53.41.81.33.55.6地美硝唑Dimetridazole85.283.493.589.91.72.71.52.24.7洛硝达唑Ronidazole53.752.954.251.21.71.03.42.49.2硝呋烯腙Difurazone52.654.355.853.86.24.76.85.08.9双甲脒Chlordimeform82.581.287.484.27.96.38.58.315.7克百威Carbofunan78.380.884.980.06.72.04.43.610.9赛拉嗪Xylazine91.690.292.293.92.71.63.93.85.7氨苯砜Dapsone72.887.476.773.34.93.12.94.610.1安眠酮Methaqualone83.089.691.988.55.53.97.67.19.6地西泮Diazepam80.185.788.587.72.16.86.24.78.9氯丙嗪Clorpromazine54.259.656.768.32.53.74.81.07.4群勃龙Trenbolone81.580.789.487.03.68.07.55.111.3诺龙Nandrolone87.391.593.690.18.17.51.67.215.9丙酸诺龙 Nandrolone propionate66.964.168.368.55.04.74.62.89.6甲睾酮 Methyl testosterone85.789.985.292.42.85.73.04.48.2丙酸睾酮 Testosterone propionate52.850.256.954.04.26.65.98.617.9醋酸甲孕酮 Mengestrol acetate90.487.086.388.73.67.02.56.110.7孔雀石绿 Malachite green51.653.457.754.31.92.84.41.77.6隐形孔雀石绿Leucomalachite green55.854.658.250.43.52.95.48.111.03.5基质效应评价液相色谱-串联质谱检测方法在建立和确证过程中需要对基质效应进行评价，确定样品基质溶液中的干扰成分对药物离子响应是否存在影响14。本实验通过测定基质匹配标准与纯溶剂标准同浓度下分析物的离子响应强度的相对比值来评价基质效应。图2为净化后的空白猪尿基质匹配标准溶液与纯溶剂混和标准溶液中药物峰面积的相对强度比，可见经固相萃取小柱净化的猪尿基质仍然对目标分析物存在不同程度的抑制作用，硝呋烯腙抑制最为严重，基质抑制效应为40.2%。为补偿基质效应的影响，采用基质匹配标准曲线进行校正。图 3 猪尿液基质对22种药物响应的影响Fig.3 Matrix effect of 22 drugs in swine urine sampleMatrix effect is the average ratio of matrix-matched standards to standards in pure solvent at four spike levels; the error bars represent standard deviations (n = 3).3.6实际样品分析为评价方法的适应性，用建立的液相色谱-串联质谱方法测定了200份来自安徽和海南的猪尿样品，结果筛查出2份克仑特罗阳性猪尿，含量分别为4.45 和2.16 mg/L。该方法操作简便，灵敏度高，能准确可靠地用于猪尿中22种违禁药物的筛查和测定。References1 Malik A K, Blasco C, Pico Y. 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