苏州大学2012年博士招生分子生物学与免疫学考题.doc

苏州大学2012年博士招生分子生物学与免疫学考题分子生物学部分1.Histone:组蛋白（histones）真核生物体细胞染色质中的碱性蛋白质，含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸特别多，二者加起来约为所有氨基酸残基的1/4。组蛋白与带负电荷的双螺旋DNA结合成DNA-组蛋白复合物。因氨基酸成分和分子量不同，主要分成5类。组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，是一类小分子碱性蛋白质，有六种类型：H1、H2A、H2B、H3、H4及古细菌组蛋白，它们富含带正电荷的碱性氨基酸，能够同DNA中带负电荷的磷酸基团相互作用。2.半不连续复制:(Semi-ondisctinuousreplication)半不连续复制是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的，故称为半不连续复制。DNA复制的最主要特点是半保留复制，另外，它还是半不连续复制。半不连续模型是DNA复制的基本过程。3.Genome:基因组，Genome，一般的定义是单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。说的更确切些，核基因组是单倍体细胞核内的全部 DNA分子；线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子；叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子。4.操纵子:操纵子（operon）：指启动基因、操纵基因和一系列紧密连锁的结构基因的总称。转录的功能单位。很多功能上相关的基因前后相连成串，由一个共同的控制区进行转录的控制，包括结构基因以及调节基因的整个DNA序列。主要见于原核生物的转录调控，如乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、组氨酸操纵子、色氨酸操纵子等5.移动因子:能从一个位置移动到另一个位置的具有生物活性的细胞因子6.Promoter:即启动子。RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。 启动子是基因（gene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（Promoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleotides），那么启动子也应由核苷酸组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子（transcription factor）的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA聚合酶RNA polymerases) 的活动。这种酶指导着RNA复制。7.癌基因:癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因。又称转化基因，它们一旦活化便能促使人或动物的正常细胞发生癌变。8.表观遗传学:表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic imprinting），母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等。9.DNA重组:DNA重组（DNA recombination）指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的关键步骤。10.Transcription factor:转录因子（Transcription factors ，TFs)。真核生物转录起始十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助，转录因子与RNA聚合酶形成转录起始复合体，共同参与转录起始的过程。根据转录因子的作用特点可分为二类；第一类为普遍转录因子它们与RNA聚合酶共同组成转录起始复合体，转录才能在正确的位置开始。TFD以外，还发现TFA，TFF，TFE，TFH等，它们在转录起始复合体组装的不同阶段起作用。第二类转录因子为组织细胞特异性转录因子，这些TF是在特异的组织细胞或是受到一些类固醇激素，生长因子或其它刺激后，开始表达某些特异蛋白质分子时，才需要的一类转录因子。1.分析讨论抑癌基因在肿瘤发生中的分子机理:抑癌基因也称为抗癌基因。正常细胞中存在基因，在被激活情况下它们具有抑制细胞增殖作用，正常情况下它们对细胞的发育、生长和分化的调节起重要作用，这些基因由于甲基化、突变等各种原因导致基因失活，或者当其产物失去活性时，可导致肿瘤的发生和癌变。抑癌基因NPRL2(nitrogen permease regulator-like 2)也称肿瘤抑制候选基因4.NPRL2基因的失活与肿瘤发生启动子区CpG岛高甲基化导致抑癌基因的失活在人染色体3p21. 3区域的抑癌基因较多见(如抑癌基因RASSF1 A).PTEN是1997年发现的抑癌基因8,即在第l0号染色体有缺失的、与细胞骨架蛋白tensin同源的磷酸酯酶基因(PTEN).P53基因是目前研究最广泛和最深入的抑癌基因之一，其突变或缺失与人类多种恶性肿瘤的发生，发展、浸润和转移密切相关。目前发现的有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、结 肠癌、前列腺癌、软组织肉瘤、卵巢癌、脑瘤、淋巴细胞肿瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等，人类肿瘤中P53突变主要在高度保守区内，以175、248、249、273、282位点突变最高，不同种类肿瘤不同，如结肠癌和乳腺癌有相似的流行病学(包括地区分布和危险因素)，但P53突变谱并不一致。Hermeking15有关p53与miRNA关系的综述，将抑癌基因p53与目前研究最热的miRNA联系起来，引起了广泛的关注。2. 试述DNA双螺旋理论对于基因工程发展的推动:1953年，Watson和Crick提出了著名的DNA分子的双螺旋结构模型，揭示了遗传信息是如何储存在DNA分子中，以及遗传性状何以在世代间得以保持。这是生物学发展的重大里程碑.生物工程的发展离不开深厚的理论基础和先进的技术基础。生物工程作为一种高新技术，它的核心是基因工程和细胞工程，尤其是基因工程。DNA碱基组成有如下规律：(1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同；(2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变；(3)几乎所有的DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相同(A=T)，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同(G=C)，总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同(AG=CT)。(4)不同生物来源的DNA碱基组成不同，表现在AT/GC比值的不同；这些结果后来为DNA的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证。Watson和Crick以立体化学原理为准则，对Wilkins和Franklin的DNA X射线衍射分析结果加以研究，提出了DNA结构的双螺旋模式（如下图），其主要内容如下： (1)在DNA分子中，两股DNA链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺旋结构，双螺旋的螺距为3.4nm，直径为2.0nm。 (2)链的骨架(backbone)由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成，位于双螺旋的外侧。 (3)碱基位于双螺旋的内侧，两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、近于平面的环形结构彼此密切相近，平面与双螺旋的长轴相垂直。一股链中的嘌呤碱基与另一股链中位于同一平面的嘧啶碱基之间以氢链相连，称为碱基互补配对或碱基配对(base pairing)，碱基对层间的距离为0.34nm。碱基互补配对总是出现于腺嘌呤与胸腺嘧啶之间(A=T)，形成两个氢键；或者出现于鸟嘌呤与胞嘧啶之间(G=C)，形成三个氢键。（如右图）(4)DNA双螺旋中的两股链走向是反平行的，一股链是53走向，另一股链是35走向。两股链之间在空间上形成一条大沟(major groove)和一条小沟(minor groove)，这是蛋白质识别DNA的碱基序列，与其发生相互作用的基础。 DNA双螺旋的稳定由互补碱基对之间的氢键和碱基对层间的堆积力(basestacking force)维系。DNA双螺旋中两股链中碱基互补的特点，逻辑地预示了DNA复制过程是先将DNA分子中的两股链分离开，然后以每一股链为模板(亲本)，通过碱基互补原则合成相应的互补链(复本)，形成两个完全相同的DNA分子。因为复制得到的每对链中只有一条是亲链，即保留了一半亲链，将这种复制方式称为DNA的半保留复制(semiconservative replication)。后来证明，半保留复制是生物体遗传信息传递的最基本方式。DNA双螺旋是核酸二级结构的重要形式。双螺旋结构理论支配了近代核酸结构功能的研究和发展，是生命科学发展史上的杰出贡献。4.以动物克隆为例，说明基因组与基因表达的关系基因组，Genome，一般的定义是单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。说的更确切些，核基因组是单倍体细胞核内的全部 DNA分子；线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子；叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子。基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。差别基因表达(differential gene expression)指细胞分化过程中，奢侈基因按一定顺序表达，表达的基因数约占基因总数的5%10%。也就是说，某些特定奢侈基因表达的结果生成一种类型的分化细胞，另一组奢侈基因表达的结果导致出现另一类型的分化细胞，这就是基因的差别表达。其本质是开放某些基因，关闭某些基因，导致细胞的分化。分子生物学中心法则？以图示解释相关内容5.分子生物学的中心法则旨在详细说明连串信息的逐字传送。它指出遗传信息不能由蛋白质转移到蛋白质或核酸之中。 （The central dogma of molecular biology deals with the detailed residue-by-residue transfer of sequential information. It states that such information cannot be transferred from protein to either protein or nucleic acid. ） 换句话说，遗传信息传到蛋白质之后，不能回流到核酸之中。中心法则经常遭到误解，尤其与遗传信息“由DNA到RNA到蛋白质”的标准流程相混淆。有些与标准流程不同的信息流被误以为是中心法则的例外，其实朊病毒是中心法则现时已知的唯一例外。遗传信息的标准流程大致可以这样描述：“DNA制造RNA，RNA制造蛋白质，蛋白质反过来协助前两项流程，并协助DNA自我复制”，或者更简单的“DNA RNA 蛋白质”。所以整个过程可以分为三大步骤：转录、翻译和DNA复制。对于RNA的最新了解，告诉我们还有剪接和编辑。6. RT-PCR原理、步骤和意义:RT-PCR 为反转录PCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。操作步骤:1. 总RNA的提取：见相关内容。2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以长沙赢润生物技术有限公司提供的操作手册为例：（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5g，补充适量的DEPC H2O使总体积达11l。在管中加10M Oligo（dT）12-18 1l，轻轻混匀、离心。（2）70加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：10PCR buffer 2l25mM MgCl2 2l10mM dNTPmix 1l0.1M DTT 2l轻轻混匀，离心。42孵育2-5min。（3）加入Superscript1l ，在42水浴中孵育50min。（4）于70加热15min以终止反应。（5）将管插入冰中，加入RNase H 1l ，37孵育20min，降解残留的RNA。-20保存备用。3PCR：（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2l上游引物（10pM） 2l下游引物（10pM） 2ldNTP(2mM) 4l10PCR buffer 5lTaq 酶（2u/l） 1l（2） 加入适量的ddH2O，使总体积达50l。轻轻混匀，离心。（3） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。（4） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。（5） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。PCR各步骤的目的编辑预变性破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。三种循环模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。延伸时间原因用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用TaqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量。3.继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。PCR引物的选择对靶序列中潜在的引物位点进行分析， 这些位点应该不会形成同源多聚体机构，也没有明显的形成二级结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。（1）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物的熔解温度。（2）选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的G+C含量相似，将产生一种大小和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的GC含量都应在40%-60%之间。（3）对寡核苷酸的长度和/或位置进行细调。使得引物的3末端核苷酸为G或C。检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律，一条引物上不该含有三个连续的与另