生物工程专业毕业论文.doc

毕业设计（论文）前言蛋白质是人体肌肉、血液、内脏、神经、骨骼、韧带、毛发、指甲和皮肤等组织的主要成分，人体许多与生命活动有关的活性物质，如酶、抗体、激素等，都是由蛋白质或蛋白质的衍生物构成。此外，蛋白质具有调节机体水平衡、酸碱平衡及体液平衡的功能。蛋白质还能供给热量，每克蛋白质在体内氧化后可产生4kcal热量乳蛋白是牛乳中最重要的营养成分之一，其中含有人体所必需的全部氨基酸，是一种完全蛋白质和最佳蛋白质。不同生长发育阶段的婴幼儿及特殊人群与正常成人对蛋白质的需求不尽相同我国对各类乳粉蛋白质含量均有具体的要求。这就要求提高测定的精密度、灵敏度主要介绍:乳粉的生产工艺，预热杀菌，浓缩，单效降膜浓缩，喷雾干燥，凯氏定氮法的原理和操作技术，乳粉中蛋白质测定方法的比较。凯氏定氮法的好处:凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算出待测物中的总氮量。凯氏定氮法与其它测定方法的比较:凯氏定氮法、双缩脲法和考马斯亮蓝染色法三种方法都可以测出被测的全部5种样品，其中凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是一种蛋白质测定的经典方法，适用样品广泛，测试结果准确。而双缩脲法和考马斯亮蓝染色法则测试过程简单、迅速，在可以准确配取标准蛋白溶液而准确性要求不高的测试中可以根据含氮量的不同选择这两种方法。等电点沉淀法多用于牛奶中酪蛋白的提取、测定。在实际生产中可与有机溶剂沉淀法、盐析法并用，以提高实验的准确性。紫外吸收法对有色被测样品是不适用的，在测无色样品时，由于其操作简便、迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰，因此也是经常被采用的蛋白质测定方法而怎样对样品进行预处理以达到紫外吸收法的测定条件也是我们今后需要探索的。关键词：凯氏定氮法 蛋白质 吸光度 Abstractmain introduction The milk production process the method and the principle operating techniques preheating sterilization, concentration, the single-action film condensed, spray drying and the Kjeldahl and the method of comparison of the milk protein determination. The benefits of the Kjeldahl method : It is used to determinate the organic nitrogen content,and if the Protein nitrogen content is known ,we can use this method to determinate the content of the protein in the samples. The comparison of Kjeldahl method and other methods: Kjeldahl method, biuret and Coomassie brilliant blue staining can all determinate the five samples. the Kjeldahl method is the analysis of organic compounds commonly used nitrogen content,and it is a protein in the classic method, widely applicable sample test results are accurate. while measuring the colorless sample, because of its operation is easy, quick and exhaust samples, and there is no interference of low concentrations of salts,so it is often applied to the determination of protein. How to do with the samples to achieve UV absorption method for the determination is what we need to explore in the future. key words:Kjeldahl method protein biuret2.乳粉的生产工艺2.1乳粉的生产工艺流程图原料奶验收计量预处理预杀菌浓缩浓缩暂存喷雾干燥冷却筛粉包装检验入库3凯氏定氮法的原理凯氏定氮法用于测定有机物的含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度降低，指示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算出待测物中的总氮量。蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。3.1实验材料1.实验器材微量凯氏定氮仪1套；50ml凯氏烧瓶4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃珠；电子万用炉；容量瓶。2.试验试剂浓硫酸；30氢氧化钠溶液；2硼酸溶液；标准盐酸溶液(0.01molL)。粉末硫酸钾硫酸铜混合物：K2SO4与CuSO45H2O以3：1配比研磨混合。混合指示剂(田氏指示剂)：由50ml0.1甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1甲基红乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。试剂配制用水为无氨蒸馏水。3.2实验操作1.安装凯氏定氮仪。2.硝化：称取1g三鹿乳粉样品，称准至0.0001g，置于500ml凯氏烧瓶，加6.0g硫酸钾，0.2g硫酸铜.再小心移入浓硫酸20ml。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。开始加热，待内容物质全部炭化。没有产生泡沫后，加大火力继续加热，直至液体变蓝色透明后，继续加热30min,冷却，缓慢加入20ml蒸馏水，再放冷到20oC,移入100ml容量瓶并定容至刻度。3.3蒸馏：(1)蒸馏器的洗涤：用水洗涤干净微量凯氏定氮仪，在蒸汽发生器中加入用几滴硫酸酸化的蒸馏水和几滴甲基红指示剂，用这样的水蒸汽洗涤凯氏定氮仪。约15分钟后，在冷凝器下端倾斜放好装有硼酸-指示剂的锥形瓶，继续蒸汽洗涤2分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。移走锥形瓶，停止加热，打开夹子。(2)蒸馏：取下棒状玻塞，用吸管吸取消化液，细心地插到反应室小玻璃杯的下方，塞紧棒状玻塞。将一个含有硼酸和指示剂的锥形瓶放在冷凝器下方，使冷凝器下端浸没在液体内。取30的氢氧化钠溶液10ml放入小玻璃杯中，轻提棒状玻璃塞使之流入反应室(为了防止冷凝管倒吸，液体流入反应室必须缓慢)。尚未完全流入时，将玻璃塞盖紧，向玻璃杯中加入蒸馏水约10ml。再轻提玻璃塞，使一半蒸馏水慢慢流入反应室，一半留在玻璃杯中作水封。加热水蒸汽发生器，沸腾后夹紧夹子，开始蒸馏。氨气进入锥形瓶，瓶中的酸溶液由紫色变成绿色。变色时起记时，再蒸馏5分钟。移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管约1厘米，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外面，继续蒸馏1分钟，移开锥形瓶，用表面皿覆盖锥形瓶。蒸馏完毕后，须将反应室洗涤干净，再继续下一个蒸馏操作。待样品和对照均蒸馏完毕后，同时进行滴定。3.4滴定：用0.1018molL的标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿色变淡紫色为滴定终点。3.5实验结果样品中氮的含量(g%)（V1-V2）C0.01M10100F100X一样品中蛋白质含量()V1一样品液消耗标准盐酸液体积(m1)V2_一试剂空白消耗标准盐酸液体积(m1)C一盐酸标准液浓度(moIL)0.0l41molL盐的标准液1ml相当于氮的克数M一样品的质量F一氮换算系数(638)结果(见表1)表1样品从复4次检测结果次序XMV1V2134.382.03220.730.02234.382.34720.84334.442.22860.80434.422.05790.742 操作过程的注意事项21 消化 t211 凯氏定氮法的误差,主要因消化操作的条件而产生 因此要格外注意。212 量取的样品倒人凯氏烧瓶时，不要将样品粘在瓶颈上， 以免加入消化液后试样碳化，粘在瓶颈上消化不彻底。消化过程中要逐渐升温，当低温加温至出现带有硫酸的白色气体后，才可升温使溶液沸腾，但应避免溶液剧烈沸腾。213 消化过程中消化液体积不可蒸至少于原来的23，更不可蒸干。若硫酸损失过多，应酌量补加硫酸：若取样量较大，如干待测样品超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。214 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30双氧水23mL后再继续加热消化。但在消化后期不得加入， 因为消化液中还原物质(如碳)含量减少， 氧化剂易造成氨进一步氧化为氮逸出使测定结果偏低。215 消化液澄清后必须继续加热沸腾30min， 以提高氮的回收率；若催化剂中有硒存在。加热时间过长也可能使氮素损失。一般情况下， 纯牛奶消化45h即可。2-2 蒸馏221 消化液加蒸馏水稀释后，应及时蒸馏，否则应保存消化液，临用时再加蒸馏水稀释。反应室加入碱液后应立即盖塞并加水封，注意各接头处的密封情况，防止漏气。222 甲基红一溴甲酚绿混合指示剂必须于临用前按比例混匀，其在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。223 蒸馏时，加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵作用外，还与消化液中的硫酸和硫酸铜作用。若加入的氢氧化钠不够，则溶液呈蓝色，不生成褐色的氢氧化铜沉淀。所以，加入的氢氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。224 蒸汽发生瓶内的水装至23体积并且保持酸性(在蒸汽发生瓶内的水中加入稀硫酸， 使之呈酸性,内加甲基橙指示剂数滴，水应呈橙红色，如变黄时，应该补加酸)，以防止在碱性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。225 因蒸馏时反应室外层的压力大于反应室内的压力，而反应室的压力大于大气压力，故可将氨带出。所以，蒸馏时，蒸汽发生要均匀，充足，蒸馏中不得停火断气，否则，会发生倒吸。停止蒸馏时 由于反应室外层的压力突然降低可使液体倒吸人反应室外层，所以，操作时，应先提高冷凝管下端的液面并清洗管口。再蒸1min后关掉热源。蒸馏是否完全，可通过精密pH试纸测冷凝管口的冷凝液来测定，中性则说明已蒸馏完全。226 在配制盐酸标准溶液时，必须将基准无水碳酸钠于27 00 灼烧至恒重后称取所须用量。否则也会影响蛋白质测定结果的准确性。3.6方法与讨论1硝化时应时候缓和加热，主要有三个方面原因：一是避免粘附在凯氏烧瓶内擘上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下未硝化完全而造成氮的损失；二是样品中脂肪、糖较多，硝化过程中易产生大量泡沫上浮外溢；三是便于充分利用冷凝酸液将附在瓶内肇上的固体残渣洗-F并促进其硝化。2加入的硫酸钾与硫酸反应生成硫酸氢钾可提高硝化液温度，一般纯硫酸沸点在340左右，而添加硫酸钾酉丁使温度升高到400以但硫酸钾加入量不宜太大。否则硝化温度过高，引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失，加入的硫酸铜除起催化剂作用外，还可指示硝化终点到达以及蒸馏时作为碱性反应指示剂(例如加碱量不足或浓度不够则硝化液只呈蓝色而无Cu(OH)2沉淀出现)。3蒸馏过程中电炉热力保持和缓，热力过大，反应室内样液沸腾剧烈在没有反应完全情况下溅入接收瓶，使结果偏低；热力不足。外界大气压力大于反应室内层及外层的压力，样品液被压出至反虚室外层，同样使结果偏低，最终蒸馏是否完全，可用精密pH试纸测试冷凝管口冷凝液确定，如呈中性，蒸馏结束。4冷凝水流速保持稳定有力，否则吸收液温度过高(40oC)，影响硼酸吸收氨的效果，给结果带来不必要的误差。4几种测蛋白质方法的比较4.1 利用等电点沉淀法测定蛋白质含量取待测样品3000rmin-1离心去脂肪后加醋酸一醋酸钠缓冲液，产生大量絮状物后再次离心，得蛋白粗品。蒸馏水洗沉淀三次，离心弃上清。转移沉淀至布氏漏斗抽滤，抽干后的制品用乙醇一乙醚等体积混合液洗涤二次，再用无水乙醚洗二次，抽干。将沉淀放在表面皿上风干，得蛋白制品称量记录每个样品做三次重复取平均值。4.2利用紫外吸收法测定蛋白质含量取待测样品制成蛋白浓度大约在0110mgml的蛋白质溶液，用紫外分光光度计进行比色，对照标准曲线得依次出样品含氮量。取7支试管，编号后按表1依次加入标准蛋白溶液和氢氧化钠溶液4.2.1标准曲线的制作表1紫外吸收法测定蛋白质含量的标准曲线溶剂配加表管号0123456标准蛋白质溶液00.51.01.52.02.53.001 mol NaOH4.03.53.02.52.01.51.0以0管为空白，在280nm下测定各管中液体的吸光度值以各管标准蛋白毫克数为横坐标，对应得A280值为纵坐标，做标准曲线图。4.2.2样品的测定取适量待测液用01molL-1Na2OH稀释10倍后装入石英比色皿中，测A280对照标准曲线求得蛋白质含量(mgml-1。)。每个样品重复三次，取平均值4.3利用双缩脲法测定蛋白质含量取待测样品制成蛋白浓度大约在110mgml-1的蛋白质溶液。加双缩脲试剂染色30min，用可见光分光光度计进行比色，对照标准曲线得出样晶蛋白质含量。4.3.1标准曲线的制作取6支试管，编号后按表2依次加入标准蛋白溶液、蒸馏水和双缩脲试剂。表2双缩脲法测定蛋白质含量的标准曲线溶剂配加表管号012345标准蛋白溶液0.00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.0以0管为空白，在540nm下测定各管中液体的吸光度值，以各管标准蛋白毫克数为横坐标，对应得A540值为纵坐标，做标准曲线图。4.3.2样品测定取适量样品，测定方法与绘制标准曲线5号管过程相同仅用被测样品代替标准蛋白溶液，根据被测样品的A540值，在标准曲线上查其对应的蛋白毫克数即为所测蛋白溶液的含量(mgml-1。)。每个样品重复三次，取平均值4.4利用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量取待测样品加入考马斯亮监G-250试剂放置5分钟后，用可见光分光光度计比色对照标准曲线得出样品蛋白质含量。4.4.1标准曲线的制作取6支试管，编号后按表3依次加入各试剂表3考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的标准曲线溶剂配加表管号012345标准蛋白溶液0.00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20.0考马斯亮蓝夜5.05.05.05.05.05.0以0管为空白，在595nm波长下比色测定并记录A595。以各管对应标准蛋白质含量为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。4.4.2样品测定取适量样品，加入5ml考马斯亮蓝G一250试剂并摇匀放置5min后在595nm波长下比色记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含鼍。每个样品重复三次，取平均值。5结果与分析51凯氏定氮法凯氏定氮法可测出全部5种样品的蛋白含量，测试结果准确，只是实验所需仪器多为特制的玻璃仪器，易于破损，特别是蒸馏与吸收装置复杂，不便于操作，实验过程所需时间较长，操作复杂。需在通风橱中进行消化，实验过程会产生毒气，并且样品与浓H2SO4共热，有一定危险。5.2等电点沉淀法等电点沉淀法可测出牛奶、豆浆、酸奶的蛋白含